一种枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一种枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物工程【技术领域】。本发明提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）菌株KF-2，保藏编号为CGMCC?No.7690，另外本发明提供了利用该枯草芽孢杆菌发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法。使用该菌株发酵豆粕后测定一些指标，粗蛋白含量达到51%以上，酸溶蛋白含量达到6%以上，活菌数达到20亿个/克发酵豆粕，挥发性盐基氮低于50mg/100g。
【专利说明】一种枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]饲料级微生物添加剂是近年来发展起来的一类新型饲料添加剂，在提高饲料利用率，增加生产性能，调节肠道微生态平衡，增加免疫力等方面具有显著的促进作用。目前在饲料及动物生产上使用较多的微生物有乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌及光合细菌，其中芽孢杆菌具有抗逆性强、耐高温高压、耐酸碱胆盐、易贮存等独特的生物特性，从动物生产和饲料工业角度评价，其能更好地满足饲料用微生物现代工业生产的要求。
[0003]枯草芽孢杆菌在代谢过程种可产生大量的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及其他有益因子，进入生物体内后能快速定殖，在肠道内形成良好的微生态环境，具有加强动物消化能力，降解抗营养因子，增加饲料利用率，增强动物免疫力等功效。我国农业部公布的可以直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种中就包括了枯草芽孢杆菌，其作为安全益生菌，现已在饲料领域得到广泛的应用。
[0004]豆柏是畜禽最重要的植物性蛋白源，其粗蛋白含量高达43%~48%，并有较平衡的氨基酸组成，尤其是含有其它植物性饲料易缺的赖氨酸，其含量高达2.5%~2.8%。但豆柏中还存在多种抗营养因子，极大地影响了豆柏的饲用价值。胰蛋白酶抑制素是豆柏中主要的抗营养因子，在豆柏中的含量为2%左右。胰蛋白酶抑制素能阻碍肠道内蛋白水解酶的作用而使蛋白质消化率下降，还能作用于胰腺本身，刺激胰腺分泌过多的胰腺酶，造成蛋白质内源代谢损失，导致动物出现消化吸收功能失调或紊乱，抑制机体的生长现象。利用微生物固态发酵可改善这一状况。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性。
[0005]但是，现报道生 产的微生物菌株存在诸多问题，如发酵时间长(因此容易引起霉变)、发酵过程水分过高，抗营养因子的降解不彻底、发酵后粗蛋白和小肽(酸溶蛋白)含量不闻等问题。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种枯草芽孢杆菌及其应用的技术方案。
[0007]本发明中的枯草芽孢杆菌(ifeci77i/5.菌株KF-2,保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，保藏日:2013 年 06 月 09 日，保藏号:CGMCCN0.7690。
[0008]所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2在发酵生产富含活性肽蛋白饲料中的应用。
[0009]所述的一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
I)将所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2经过平板培养基活化、种子摇瓶培养、一级摇瓶培养或发酵罐逐级放大培养，得到种子液；2)经步骤I)得到的种子液接种至豆柏中进行固态发酵；
3)将步骤2)得到的发酵产物进行烘干、粉碎，即得到富含活性肽蛋白饲料。
[0010]所述的一种利用枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤2)中接种量为豆柏重量的8~12%。
[0011]所述的一种利用枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤2)中固态发酵条件为:接种时进行充分搅拌，发酵过程中监测温度变化，温度高于50°C时，进行翻料处理，发酵时间为48 h。
[0012]所述的一种枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤3)中发酵产物烘干至水分< 12%，粉碎细度40~60目。
[0013]本发明诱变得到一种枯草芽孢杆菌菌株KF-2，该菌株能够分泌丰富的蛋白酶等酶系，具有显著的发酵豆柏的能力。利用该菌株及相应的发酵工艺对豆柏进行固态发酵处理，可降解豆柏粉中大分子量的蛋白质，使其转化成具有生物活性的小肽蛋白，促进了动物的吸收。同时，豆柏发酵后其中的抗营养因子和抗原蛋白得到了有效地降解，显著提高豆柏的营养品质，提高动物对豆柏的利用效率并改善动物肠道和促进健康。
[0014]使用该菌株发酵豆柏后显著改善了豆柏的营养价值，测定一些指标结果为:发酵豆柏的粗蛋白含量达到51%以上，酸溶蛋白含量达到8%以上，活菌数达到40亿个/克发酵豆柏，挥发性盐基氮低于50 mg/100g,同时含有较高的蛋白酶活性。
【具体实施方式】
[0015]为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
[0016]实施例1:枯草芽孢杆菌菌株KF-2的分离、纯化、诱变和鉴定
从自然条件下筛选获得枯草芽孢杆菌，后经过本公司的多轮诱变育种后，菌株得到了遗传改良，其降解和转化豆柏的能力得到了明显提高，菌株的生产性能大大提高。
[0017]制备牛肉膏蛋白胨培养基平板，从豆类等有机质中分离培养，获得枯草芽孢杆菌，获得的菌株经过菌落观察、形态学显微鉴定为枯草芽孢杆菌。
[0018]利用枯草芽孢杆菌发酵豆柏，反复筛选和提纯复壮(步骤:从发酵较好的豆柏产品中分离培养枯草芽孢杆菌，获得纯化菌株继续培养，然后进一步发酵豆柏，使其发酵能力不断提高)，使得菌株发酵豆柏的性能得到了提高，表现在发酵豆柏后活菌数增强、酸溶蛋白含量提高等方面(豆柏蛋白含量可以达到5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高10%以上，乳酸含量提高2%以上)，该菌株命名为枯草芽孢杆菌菌株KF-2。
[0019]枯草芽孢杆菌菌株KF-2培养和繁殖方法:
枯草芽孢杆菌菌株KF-2在牛肉膏蛋白胨培养基平板上生长良好，该培养基可用于枯草芽孢杆菌菌株KF-2的生长和繁殖。培养温度32°C。牛肉膏蛋白胨培养基含量为牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂15~20g、蒸馏水IOOOmL, pH 7.0~7.2。
[0020]枯草芽孢杆菌菌株KF-2的形态学特征:
枯草芽孢杆菌KF-2属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为革兰氏阳性菌，显微镜下观察可见短杆状的菌体，菌体细胞大小为0.68~0.85X2.0~3.1微米，菌体着色均匀，培养一定时间后，菌体细胞内可形成芽孢，芽孢大小为0.6~0.9 X 1.0~1.5微米。芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏的位置，芽孢形成后菌体不膨大。枯草芽孢杆菌KF-2无荚膜，周生鞭毛，能运动。
[0021]培养特性:枯草芽孢杆菌KF-2菌株单菌落接种后，在牛肉膏蛋白胨培养基上32 °C、培养3天后，菌落呈现出表面粗糙，不透明，浅白色或微黄色。培养菌落表明有皱褶，菌落略显干燥，较平整，不易挑起。
[0022]枯草芽孢杆菌KF-2接种后，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上生长15h后，就有大量的芽孢产生。
[0023]生理特性和代谢特性:枯草芽孢杆菌KF-2易培养，能利用蛋白质、多种糖及淀粉等多种有机物质。是需氧菌，能够迅速消耗环境中的游离氧，可以作为动物肠道菌培养，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长。
[0024]枯草芽孢杆菌KF-2发酵有机物可产生乳酸、丙酸等有机酸。
[0025]枯草芽孢杆菌KF-2产生的生物酶种类较多，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。在大豆分离蛋白、酪蛋白等培养基上有明显的水解圈，显示出较高蛋白酶活性。在淀粉平板上，经过碘染色观察有透明圈，显示出淀粉水解酶活性。
[0026]枯草芽孢杆菌KF-2的具体用途和效果:枯草芽孢杆菌{Bacillus subtil is)菌株KF-2可以用来发酵豆柏，生产富含活性小肽的高蛋白饲料。
[0027]发酵后的豆柏蛋白含量可以达到5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高明显，可以提高10%以上，乳酸含量提高2%以上。发酵产物中，富含蛋白酶、淀粉酶等丰富的酶系，可以降解豆柏中的抗营养因子等有害物质。同时，发酵豆柏中含有大量的抗逆性较强的枯草芽孢杆菌芽孢，便于贮存和运输。在动物食用后，枯草芽孢杆菌在肠道内迅速繁殖，显著抑制有害菌的生长，改善动物肠道健康，提高饲料的利用率，改善动物营养水平，产生良好的经济效益和生态效益。
[0028]实施例2:利用枯草芽孢杆菌KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法
I)将所述的枯草芽孢杆菌KF-2经过平板培养基活化、种子摇瓶培养、一级摇瓶培养或发酵罐逐级放大培养，得到种子液，上述的平板培养基、摇瓶培养基均为PDA培养基；平板培养基活化是从斜面保存的菌株转接到平板，32°C培养，然后从平板挑取3个单菌落到种子摇瓶，种子摇瓶在32°C、150 r/min摇床条件下,培养15 h后,种子培养液全部接种到发酵罐，发酵罐通气培养24h。
[0029]上述的平板培养基为:牛肉膏、蛋白胨培养基(牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0~7.2)，种子摇瓶培养基为:上述平板培养基不加琼脂，发酵培养基:同种子培养基。
[0030]2)经步骤I)得到的发酵罐中的菌种液按豆柏重量的8~12%接种至豆柏中进行固态发酵，接种时进行充分搅拌，确保菌种和豆柏混合均匀，发酵的时间为48 h，发酵过程中监测温度变化，温度高于50°C时，进行翻料处理，充分透气降温，温度较低时，适当延长发酵时间，此外，发酵过程中还需观察发酵是否正常、气味是否具有豆香和酵母酒香味、发酵物中有没有发黑、霉变、结块等。[0031]3)将步骤2)得到的发酵产物烘干至水分< 12%，粉碎至细度40~60目，即得到富含活肽蛋白饲料。[0032]经鉴定，实施例2得到的富含活肽蛋白饲料中粗蛋白含量达到51%以上，酸溶蛋白含量达到6%以上，活菌数达到20亿个/克发酵豆柏，挥发性盐基氮低于50mg/100g，蛋白含量比初始豆柏原料可以提高5%以上，酸溶蛋白等小肽含量提高4%以上，乳酸含量提高1%以上 。
【权利要求】
1.枯草芽孢杆菌(及?&77心菌株KF-2，保藏编号为CGMCCN0.7690。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2在发酵生产富含活性肽蛋白饲料中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于包括以下工艺步骤: 1)将所述的枯草芽孢杆菌菌株KF-2经过平板培养基活化、种子摇瓶培养、一级摇瓶培养或发酵罐逐级放大培养，得到种子液； 2)经步骤I)得到的种子液接种至豆柏中进行固态发酵； 3)将步骤2)得到的发酵产物进行烘干、粉碎，即得到富含活性肽蛋白饲料。
4.如权利要求3所述的一种利用枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤2)中接种量为豆柏重量的8~12%。
5.如权利要求3所述的一种利用枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤2)中固态发酵条件为:接种时进行充分搅拌，发酵过程中监测温度变化，温度高于50°C时，进行翻料处理，发酵时间为48 h。
6.如权利要求3所述的一种枯草芽孢杆菌菌株KF-2发酵生产富含活性肽蛋白饲料的方法，其特征在于所述的步骤 3)中发酵产物烘干至水分< 12%，粉碎细度40~60目。
【文档编号】C12N1/20GK103468604SQ201310327938
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月31日 优先权日:2013年7月31日
【发明者】章亭洲 申请人:浙江科峰生物技术有限公司