乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用的制作方法

文档序号:515703阅读:363来源:国知局
乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒,包含乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列,或乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列。本发明还公开了一种乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株,该弱毒株是乙型脑炎病毒弱毒株10S3的克隆毒株,所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明的乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒,在细胞上拯救出的乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株,在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保护,非常有利于乙型脑炎病毒的预防和控制。
【专利说明】乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】,尤其涉及一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克 隆质粒及其应用。

【背景技术】
[0002] 乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)是一种重要的人畜共患病 病原,属黄病毒科黄病毒属(Flavivirus),该属重要成员还包括黄热病毒(Yellow Fever Virus, YFV)、登革病毒(Dengue Virus, DENV)和西尼罗河病毒(West nile virus, WNV)等。 JEV基因组是一单股正义RNA,有5'帽、无3'多聚腺苷尾,全长约llkb。基因组编码单一 长开放阅读框,两侧是5'非编码区(5' -untranslated region, 5' -UTR)和3'非编码区 (3' -UTR)。单个长开放阅读框翻译产生一个多聚蛋白,多聚蛋白在翻译中或翻译后裂解成 10个蛋白。N端占多聚蛋白长度四分之一的序列编码结构蛋白(C-prM-E),其余部分是非结 构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)。依据E蛋白基因序列,可将JEV分成五个基 因型(genotype)。
[0003] JEV由蚊传播,可感染人和马、猪、野生水禽等多种动物。感染人和马,主要呈现脑 炎神经症状。人感染发病后,死亡率可高达20%,而幸存者大多留有脑炎后遗症,危害甚重。 而猪只不分大小均可感染该病毒,临床可表现出新生仔猪脑炎和种猪繁殖障碍,如流产、死 胎和睾丸炎,给养猪业造成重大经济损失。其它动物则表现为隐性感染。猪在JEV循环传 播中也起重要作用,猪不仅是中间宿主,还是JEV传播的扩增器。猪感染JEV后,病毒血症 持续的时间长,病毒滴度高,吸食猪血的蚊都可被感染成为带毒蚊,从而扩大蚊对JEV的传 播。因此,必须加强对猪群中JEV的防治工作。
[0004] 我国是JEV的主要流行地区,目前除青海未报道外,其他各省市均存在JEV流行, 每年JE病例在数千例以上。分子流行病学调查显示,1978年前我国流行的JEV均属基因 III 型(Genotype III,GIII),但 1978 年出现首株基因 I (Genotype I,GI),在随后的 20 年 间我国处于GI和GIII共流行的态势。近年来,我国从脑炎患者、猪、蚊体内分离出多株GI, GI JEV流行呈上升趋势。疫苗接种是预防JE的有效途径。目前,我国普遍给儿童接种JEV 疫苗株SA14-14-2,而猪用JEV疫苗株也为SA14-14-2。SA14-14-2是由SA14株致弱而来, 同属GIII。研究显示,GIII疫苗诱导抗体,对GI JEV仅具有部分中和能力。因此,需要开 发新的兽用疫苗,来预防猪群中JEV的流行。
[0005] 自上世纪八十年代以来,病毒感染性克隆技术的兴起和发展极大地促进了病毒的 研究。由于感染性克隆技术可以直接操作病毒基因组序列,可以根据研究者的目的改变病 毒的遗传序列,已逐渐成为研究病毒基因组复制与表达、病毒蛋白的功能、病毒与宿主间的 相互作用、构建新型病毒载体和研制新型疫苗的重要平台。但在利用感染性克隆技术研究 JEV过程中,存在一大障碍就是JEV基因组cDNA克隆在宿主菌中不稳定,容易产生核苷酸缺 失、插入等突变现象,导致病毒的感染性克隆难以建立。


【发明内容】

[0006] 本发明要解决目前预防乙型脑炎的GIII疫苗诱导的抗体对GI型JEV仅具有部分 中和能力,急需开发新的乙脑兽用疫苗的技术问题,提供一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感 染性克隆质粒,通过该重组感染性克隆质粒拯救出的感染性JEV病毒,在免疫小鼠后可使 小鼠抵抗乙型脑炎病毒GI株的攻击,为动物提供完全的免疫保护,适于开发成乙型脑炎病 毒感染性克隆弱毒疫苗株。
[0007] 此外,还需要提供一种上述乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒的应用。
[0008] 为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:
[0009] 在本发明的一个方面,提供了一种重组质粒,包含:乙型脑炎病毒弱毒株10S3的 全长基因 cDNA序列,该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 在本发明的一个方面,提供了一种重组质粒,包含:乙型脑炎病毒弱毒株10S3的 全长基因 cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列,该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 优选的,所述弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列内部引入的标记性酶切位点是通 过定点突变将该弱毒株10S3的全长基因第9291位碱基C突变成G而引入的SacII酶切位 点。
[0012] 优选的,所述全长基因 cDNA序列5'末端还加设有T7启动子;所述全长基因 cDNA 序列3'末端还加设有丁型肝炎病毒核酶序列(HDVr序列)。
[0013] 在本发明的另一方面,提供了一种感染性克隆弱毒株,所述感染性克隆弱毒株是 通过将上述重组质粒线性化,再将该线性化的全长CDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得 的感染性乙型脑炎病毒。
[0014] 在本发明的另一方面,还提供了一种乙型脑炎病毒弱毒株,所述乙型脑炎病毒弱 毒株的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0015] 在本发明的另一方面,还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备预防乙型脑炎 的疫苗中的应用。
[0016] 在本发明的另一方面,还提供了一种上述乙型脑炎病毒弱毒株在制备预防乙型脑 炎的疫苗中的应用。
[0017] 在本发明的另一方面,还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备区分乙型脑炎 疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。
[0018] 在本发明的另一方面,还提供了一种区分乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感 染毒株的检测试剂盒,包含:针对引入的标记性酶切位点设计的特异性引物、标记性的限制 性内切酶。
[0019] 利用针对引入的标记性酶切位点设计合成的特异性引物,通过RT-PCR及进一步 的限制性酶切,可以有效区分出乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感染毒株。
[0020] 优选的,针对引入的位于病毒基因组9287-9292位核苷酸的SacII酶切位点设计 特异性引物。
[0021] 本发明乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒,在细胞上拯救出的乙型脑炎病 毒感染性克隆弱毒株,不仅在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保 护,而且能有效区分乙型脑炎疫苗免疫动物与乙型脑炎病毒自然感染动物,满足临床上对 乙型脑炎病毒疫苗免疫毒株与自然感染毒株的鉴别诊断,非常有利于乙型脑炎病毒的预防 和控制,应用前景十分广阔。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0023] 图1是本发明实施例2的10S3弱毒株全基因组扩增结果图;
[0024] 图2是本发明实施例3加 T7启动子序列的PCR产物电泳结果图;
[0025] 图3是本发明实施例3加 HDVr序列的PCR产物电泳结果图;
[0026] 图4是本发明实施例3全长克隆pAHEN构建示意图;
[0027] 图5是本发明实施例3转录本RNA电泳图;
[0028] 图6是本发明实施例3的10S3全长感染性克隆线性化转录后在BHK-21细胞上转 染及传代结果图;
[0029] 图7是本发明实施例3的JEV NS3单抗的间接免疫荧光鉴定结果图;
[0030] 图8是本发明实施例3引物PJEF8791/PJER10965的PCR扩增结果图;
[0031] 图9是本发明实施例3的SacII酶切结果图;
[0032] 图10是本发明实施例4的vAHEN和10S3的一步生长曲线比较图;
[0033] 图11是本发明实施例4的vAHEN和10S3的空斑试验结果图。

【具体实施方式】
[0034] 下列实施例中,未注明具体条件的实验方法,通常按常规条件,如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编,马学军,舒跃龙的译.北京: 科学出版社,2004)中所述的方法进行。
[0035] 本发明将猪源JEV GI野毒株HEN0701在BHK-21细胞上连续传代,并经过纯化和 筛选获得一株弱毒株10S3株。克隆并测定了弱毒株10S3的全基因组(SEQ ID N0. 1),发现 其与野毒株存在19处核苷酸变异。然后,本发明利用反向遗传操作技术,采用分段克隆逐 一拼接的策略在PBR322载体中构建了弱毒株10S3的全长克隆pAHEN,通过定点突变方法, pAHEN在病毒基因组9291处携带有SacII遗传标记。pAHEN线性化后体外转录出RNA,RNA 转染BHK-21细胞,拯救出病毒vAHEN。vAHEN能与JEN NS3特异性单抗结合,通过检测也发 现vAHEN携带有SacII遗传标记,该引入的SacII遗传标记在自然流行毒株的基因组中并 不存在,它是本发明人工构建的感染性克隆毒株的特有标志,而且本发明的构建既不影响 病毒复制和免疫保护效果,又可以用来区分乙型脑炎感染性克隆弱毒株与自然感染毒株。
[0036] 本发明拯救出的乙型脑炎感染性克隆弱毒株vAHEN,通过一步生长曲线和空斑试 验,显示vAHEN与10S3体外生长特征相似。vAHEN通过颅内和皮下接种,均不致死小鼠,呈 现弱毒特征。vAHEN接种小鼠,能保护抵抗HEN0701攻击。本发明成功构建出的JEV弱毒株 的感染性克隆pAHEN,为利用反向遗传学研究JEV、开发新型感染性克隆弱毒疫苗和构建新 型病毒载体等都具有重要意义。
[0037] 下面通过实施例,具体阐述本发明。
[0038] 在本发明的下述实施例中,使用的实验材料如下:
[0039] 病毒和细胞:BHK-21细胞(美国细胞保藏中心ATCC,保藏号为:CCL-10),乙型脑 炎病毒HEN0701株(本实验室保存;发表文章见:郑浩,张建武,袁世山.猪源乙型脑炎病 毒的分离鉴定及其E基因分析.中国兽医科学,2009, 39(6) :476-481)。
[0040] 质粒与菌株:pBR322,购自 Promega ;pCR_Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0 购自 Invitrogen 公司; T0P10感受态购自北京天根。
[0041] 其他试剂:MEM,GIBC0公司产品;吣《、5&(:1、乂11〇1、乂11^1和了40嫩连接酶,册8公司 产品;SuperScriptP? PII Reverse Transcriptase购自 Invitrogen公司;DNA片段小量快 速回收试剂盒,北京博大泰克生物基因技术公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit和QIApr印 Spin miniprep Kit,QIAGEN 公司产品。
[0042] 在本发明的实施例中,BHK-21细胞的培养方法如下:
[0043] BHK-21细胞在含有10%FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后, 弃去细胞培养瓶中培养基,并以PBS洗一次,以0. 25%的胰酶将细胞消化下,加入新的含有 10%FBS的MEM培养基,以1:8的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
[0044] 实施例1乙型脑炎病毒(JEV) HEN0701传代致弱株的筛选
[0045] 将JEV GI株HEN0701在BHK-21细胞上连续传代100代,并以空斑连续纯化10次, 挑选6个克隆毒通过皮下和颉内接种小鼠,筛选弱毒株。具体过程如下:
[0046] 1. 1病毒传代
[0047] 将35mm细胞培养皿中生长成融合单层的BHK-21细胞,以lmL PBS洗一次,将 HEN0701株接种BHK-21细胞。37°C孵育lh后,以lmL PBS洗一次,每平皿加入2. 5mL含 2%FBS的MEM维持培养液,置于37 °C含5%C02的培养箱。接种HEN0701的平皿中BHK-21 细胞病变达70-80%时,收获细胞上清,分装于1. 5mL离心管,冻存于-70°C,该批病毒称之 为HEN0701P1。按上述方法,将HEN0701P1以原液0. 3mL接种BHK-21细胞,收获病毒称为 HEN0701P2。将HEN0701P2接种BHK-21细胞,收获HEN0701P3。如此,将病毒在BHK-21细胞 上传代至HEN0701P100。
[0048] 1. 2病毒的空斑纯化
[0049] 以DMEM将HEN0701P100以1:10稀释至ΚΓ5和ΚΓ6。生长于60mm平皿中的融合单 层BHK-21细胞,以PBS洗两次,将10_ 5和10_6的病毒稀释液分别以lmL接种一平皿。37°C 孵育lh后,每平皿以3mL DMEM洗二次,加入12mL含1%低熔点琼脂糖和2%FBS的覆盖培养 基。于37°C、5%C02中培养4d,挑起单个病毒空斑置入0. 3mL DMEM中,冻存于-75°C。以上 述方法,挑取6个空斑连续纯化10轮,获得6株克隆毒,分别称之为:8S1、8S2、9S1、10S1、 10S2 和 10S3。
[0050] 1.3对小鼠的致病力
[0051] 以DMEM培养液将6株克隆毒和HEN0701P1作适当稀释,并添加青霉素-链霉素 至100IU/mL,分别以脑内和皮下两种方式接种3w小鼠。传代克隆毒株,分别以0. 05mL (含 106pfu)脑内接种和0· lmL(含2X106pfu)皮下接种小鼠,各7只;HEN0701以103pfu脑内 接种和2 X 104pfu皮下接种小鼠,各7只;同时以DMEM0. 05mL脑内接种和0. lmL皮下接种7 只小鼠作对照。皮下接种小鼠,接种前以接种针穿刺脑膜。接种后观察2w。6株克隆株皮 下接种,小鼠全部存活,无伤残。通过脑内接种,8S2和10S3组全部存活,且无伤残;9S1组 7只均存活,但其中一只后腿瘫痪;10S1组6只存活,1只死亡,无伤残;10S2组5只存活,2 只死亡,存活小鼠中有一只后腿瘫痪;8S1组7只小鼠全部死亡。HEN0701株通过脑内和皮 下接种小鼠,3d后开始出现死亡,至lid全部死亡。对照组小鼠脑内和皮下接种,均存活。 以上结果显示,经过细胞传代和纯化,6株克隆株都丧失了对3周小鼠的脑外毒力,但仅有 8S2和10S3丧失了对3周小鼠的脑内毒力,而8S1、9S1、10S1和10S2保留有脑内毒力。
[0052] 为了进一步比较8S2和10S3的毒力,以0. lmL病毒液(含2 X 106pfu)腹部皮下 接种8只7d乳鼠,将同窝剩余的3-4只乳鼠接种0. lmL DMEM作对照,接种前以接种针穿刺 脑膜。接种后3w,8S2组5只存活,3只死亡;10S3组8只均存活。这表明,10S3比8S2毒 力要弱。
[0053] 实施例210S3全基因组的克隆
[0054] 根据Genbank中登录号为FJ495189的JEV HEN0701株全基因组序列,设计合成4 对引物,分别作为RT和PCR引物。从JEV致弱株10S3感染上清中提取病毒基因组RNA,反 转录合成cDNA,以其作为PCR模板,利用4对引物进行PCR扩增,获得4个cDNA片段,将4 个cDNA片段分别克隆入pCR-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0载体中,挑选阳性克隆并测定克隆cDNA序列。 利用DNAStar中的SeqMan软件,将测得序列进行拼接,获得全长病毒基因组序列。并用 DNAStar中的MegAlign软件将测得的10S3基因组序列与HEN0701进行比对分析。具体过 程如下:
[0055] 2. 1引物设计
[0056] 根据Genbank中登录号为FJ495189的JEV HEN0701株全基因组序列,设计合 成 4 对引物,分别命名为:PJEF1/PJER2913、PJEF2371/PJER5675、PJEF5455/PJER9204、 PJEF8791/PJER10965。具体引物序列见下表1 :
[0057] 表110S3全基因组cDNA片段扩增引物
[0058]

【权利要求】
1. 一种重组质粒,其特征在于,包含:乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因 cDNA序 列,该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种重组质粒,其特征在于,包含:乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列 内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列,该弱毒株10S3的全长基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
3. 根据权利要求2所述的重组质粒,其特征在于,所述弱毒株10S3的全长基因 cDNA序 列内部引入的标记性酶切位点是通过定点突变将该弱毒株10S3的全长基因第9291位碱基 C突变成G而引入的SacII酶切位点。
4. 一种感染性克隆弱毒株,其特征在于,所述感染性克隆弱毒株是通过将权利要求1 所述重组质粒线性化,再将该线性化的全长cDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得的感染 性乙型脑炎病毒。
5. -种感染性克隆弱毒株,其特征在于,所述感染性克隆弱毒株是通过将权利要求2 所述重组质粒线性化,再将该线性化的全长cDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得的感染 性乙型脑炎病毒。
6. -种乙型脑炎病毒弱毒株,其特征在于,所述乙型脑炎病毒弱毒株的全长基因 cDNA 序列如SEQ ID NO. 1所示。
7. 权利要求4或5所述的感染性克隆弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。
8. 权利要求6所述的乙型脑炎病毒弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。
9. 权利要求5所述的感染性克隆弱毒株在制备区分乙型脑炎感染性克隆弱毒株与自 然感染毒株的产品中的应用。
10. -种区分乙型脑炎的感染性克隆弱毒株与自然感染毒株的检测试剂盒,其特征在 于,包含:针对引入的标记性酶切位点设计的特异性引物、标记性的限制性内切酶。
【文档编号】C12N15/63GK104152476SQ201310355065
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】郑浩, 童光志, 郑旭晨, 童武, 马志永, 郭亦非 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所
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