一种基于猪cd163基因的双荧光素酶报告基因载体的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜基因工程【技术领域】，涉及一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体的构建及应用。通过对PRRSV一关键受体基因猪CD163扩增测序获得该基因3’UTR区完整片段，预测调控猪CD163基因3’UTR区候选microRNAs和作用靶点，扩增含有作用靶点的猪CD163基因的序列，将其插入双荧光素酶载体构建猪CD163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体psi-CHECK2-CD163-3UTR。该载体可用于检测候选microRNAs对猪CD163基因表达的调控活性及用于筛选抑制猪CD163基因表达的microRNAs等。
【专利说明】—种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体【技术领域】
[0001]本发明属于家畜基因工程【技术领域】，具体涉及一种基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体，该载体可以用于筛选检测调控猪CD163基因表达的候选microRNAs，探讨其抑制PRRSV感染增殖的作用，从而用于间接筛选抗猪繁殖呼吸综合征病毒感染的microRNAs,进一步用于microRNAs抗猪繁殖呼吸综合征的研究中。
【背景技术】
[0002]猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)，因发病猪耳部发绀呈紫红色斑块状，又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种危害极大的传染病，该病主要导致母猪繁殖障碍(流产、死胎和木乃伊胎增多等)、仔猪呼吸道症状和高死亡率、公猪精液品质下降等。自1987年首次在美国发现以来，几年之内PRRSV席卷了北美洲、欧洲、亚太地区和国家。Neumann评估PRRS每年使美国养猪业收入减少将近6亿美元，远远超过猪瘟和伪狂犬病的3.64亿美元和
0.64亿美元。目前PRRS被公认为是危害养猪业的头号传染病。由于PRRSV破坏宿主免疫系统，导致持续感染；PRRSV变异性高，且感染致病的分子机理和免疫机制等尚不清楚，限制了安全高效疫苗和药物的研制，目前还没有一种疫苗能对猪体产生完全有效的保护。因此深入研究PRRSV致病及猪抗病机理、寻找防治PRRS新药设计的靶分子、培育抗病新品种(系)是当务之急。
[0003]⑶163是PRRSV感染宿主细胞的关键受体之一，参与介导病毒的内吞和增殖。CD163 是清道夫受体(Scavenger receptor cysteine-rich, SRCR)超家族成员之一，结构包含信号肽、9个串联的SRCR末端重复序列、一个跨膜区和胞质尾区。⑶163是在2005年首次被发现与PRRSV感染有关，实验表明PRRSV非易感的系猪肾细胞表达CD163后，可以被PRRSV感染并产生病毒增殖能力。随后，Calvert等将从各种细胞系中分离获得的CD163分子转染到PRRSV非敏感的细胞系后，这些细胞内都产生子代病毒粒子，证明CD163确实是PRRSV感染有关的受体。猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV的天然靶细胞，而采用⑶163的抗体可以有效阻止PRRSV感染PAM。且有报道表明永生化后的PAM细胞系因无法正常表达⑶163而变为PRRSV非易感细胞。⑶163的表达量高低与PRRSV增殖率呈正相关，上调⑶163表达(用IL-10处理)会增加病毒增殖，下调⑶163表达(用TPA或LPS处理)可降低病毒增殖；并且采用⑶163的抗体可以有效阻止PRRSV感染猪PAM细胞。本人参与的前期研究结果表明CD163基因的第11号外显子上SNP不同基因型与PRRSV抗体水平密切相关，这些SNP导致的氨基酸变化与PRRSV的感染有关。
[0004]MicroRNA (简称:miRNA)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约为20-25个核苷酸，由具有发夹结构的70-90个碱基大小的单链RNA前体(pre-miRNA)加工而来,能够互补或部分互补的祀mRNA结合,使mRNA降解或介导其翻译抑制。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，它们介导了转录后的基因调控。成熟的miRNA可同时封闭多个靶基因的翻译，干预调节miRNA可改变多个靶基因的表达水平，且干预调节效率很高。越来越多的研究表明miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用。在人单核细胞中发现miR-146a在细菌诱发的天然免疫中起作用，而对以病毒为抗原的免疫反应无效。在人肺泡上皮细胞中，增加miR-146a的表达可对促炎因子IL-8和RNATES的释放有着负调节作用。在小鼠巨噬细胞中发现，miR-155在细菌和病毒诱导的免疫反应中均具有一定调节作用，缺少miR-155或其前体的实验小鼠，其获得性免疫应答呈现减弱状态，在血管内注射沙门杆菌typhimurium属后,无法建立相关的免疫应答,这种免疫应答的减弱可归咎于B细胞和T细胞功能损害以及树突状细胞的递呈缺陷。在免疫系统中，miRNAs在B淋巴细胞的早期分化及效应B淋巴细胞的分化过程中发挥了关键作用。在T淋巴细胞中，miRNA被发现是谱系诱导通路里的关键调节因子，同时也在调节性T细胞谱系的诱导，功能维持方面发挥了很重要的作用。miRNA在通过Toll样受体调节树突状细胞与巨噬细胞的分化过程中不可或缺，它能在细胞活化之前抑制其效应功能的发挥，并在刺激之后增强作用。可见，miRNA在免疫系统中起到关键调控作用，它甚至可能是细胞最原始的免疫方式。
[0005]综上所述，猪⑶163基因在PRRSV感染宿主猪细胞的过程中起关键作用，同时miRNA介导的基因调控对调节机体免疫功能具有重要作用，广泛参与机体抗病毒反应。如近期有研究表明，miR-181可通过结合PRRSV基因组序列可抑制PRRSV增殖。miRNA多数是通过与靶基因的3’ UTR区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，而目前猪⑶163基因的3’ UTR序列并不完整，无法进行调控猪⑶163基因表达的候选miRNAs的研究，因此，获得猪CD163基因3’ UTR区完整序列并构建其双荧光素酶报告载体，可用于筛选获得调控⑶163基因表达的候选miRNAs，也可作为抑制PRRSV感染增殖的候选miRNAs做进一步研究。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，扩增获得猪CD163基因3’UTR区序列，以预测可调控该基因表达的miRNAs及靶点。
[0007]本发明的进一步目的是提供一种猪⑶163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体及其构建方法。
[0008]本发明通过以下技术方案实现:
[0009] 申请人:参考GeneBank猪CD163基因的cDNA序列(登录号ΝΜ_213976.I),通过cDNA3’末端快速扩增(3’RACE)技术扩增获得猪⑶163基因3’UTR区片段，测序获得其⑶S下游新的长度为181bp DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:3所述。3’RACE扩增的槽式降落PCR上游特异性引物序列如下:
[0010]外引物:5，CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC3’
[0011]内引物:5 ’TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3 ’
[0012]利用TargetScan生物学软件预测可调控⑶163基因3’ UTR区的物种间保守的miRNAs (miR-181a, b, c, d、miR-4262、miR-23a, b, c 等)及作用靶位点序列(TGAATGT 和AATGTGA) (http://www.targetscan.0rg/cg1-bin/targetscan/vert_61/view_gene.cgi ?taxid=9606&rs=NM_203416&memb ers=&showcnc=0&shownc=0&showncf=),并发现新扩增获得的猪3’ UTR区也包含这些保守miRNAs的作用靶位点序列。[0013]根据获得的猪⑶163基因的全序列，设计包含3’ UTR区的一对引物，在5’端和3’端分别引入XhoI (CTCGAG)和NotI (GCGGCCGC)酶切识别位点及保护碱基，利用PCR方法扩增猪⑶163基因片段，其序列如SEQ ID:6所示，长度为469bp，并纯化PCR产物。其引物序列如下:
[0014]上游引物:5’CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC3’
[0015]下游引物:5’ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG3’
[0016]将扩增获得的猪⑶163基因3’ UTR区片段插入双荧光酶报告载体psi_CHECK2的XhoI和NotI酶切位点，构建猪⑶163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体， 申请人:将这个载体命名为ps1-CHECK2-CD163-3UTR，其插入核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:6所示。
[0017]本发明的双荧光素酶报告基因载体ps1-CHECK2-⑶163-3UTR，可用于非诊断目的的对候选miRNAs对猪CD163基因表达的调控活性的检测，用于筛选可抑制猪CD163基因表达的 miRNAs。
[0018]更详细技术细节如《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]序列表SEQ ID NO:1是3’末端快速扩增的槽式降落PCR外引物的上游引物序列。
[0020]序列表SEQ ID NO:2是3’末端快速扩增的槽式降落PCR外引物的下游引物序列。
[0021]序列表SEQ ID NO:3是扩增测序获得的猪CD163基因3’ UTR区的181bp DNA序列。
[0022]序列表SEQ ID NO:4 是PCR扩增猪CD163基因469bp片段的上游引物序列。
[0023]序列表SEQ ID NO:5是PCR扩增猪CD163基因469bp片段的下游引物序列。
[0024]序列表SEQ ID NO:6是PCR扩增猪CD163基因469bp片段核苷酸序列，该序列包含酶切位点和保护碱基序列。
[0025]序列表SEQ ID NO:7是本发明构建的载体ps1-CHECK2-CD163_3UTR核苷酸的全序列。
[0026]图1:是本发明的总体技术流程图。
[0027]图2:是猪⑶163基因3’ RACE PCR扩增结果图。图中:泳道I为第一轮PCR扩增结果，泳道2为第二轮PCR扩增结果，泳道M是IOObp DNA Ladder。
[0028]图3是猪⑶163基因3’UTR扩增序列，用于构建载体的目的片段。泳道Ml是IOObpDNA Ladder，泳道M2 是 DL2000DNA Marker，泳道 CD163 是扩增的猪 CD163 基因 3’UTR 片段。
[0029]图4是空载体psi_CHECK2的结构图谱。
[0030]图5是本发明构建的载体ps1-CHECK2-CD163_3UTR结构图谱。
[0031]图6是构建的猪⑶163基因3’UTR双荧光素酶报告基因载体酶切鉴定图。泳道Ml是DLIOOOODNAMarker，泳道M2是IOObp DNA Ladder,泳道1，2，3是载体双酶切后片段。
[0032]图7 是 miRNA 和 ps1-CHECK2-CD163-3UTR共转染 Marc-145 细胞 48h 后相对荧光素酶检测结果。图中:纵坐标Related Luciferase Activity表示相对突光活性值,**P〈0.01。
【具体实施方式】
[0033]实施例1[0034]1.猪 CD163 基因 3’ RACE 测序
[0035]1.1引物设计
[0036]参考猪CD163基因GenBank的cDNA序列(登录号:NM_213976.1)设计外、内两个上游特异性引物，结合宝生物工程大连有限公司的3’ RACE试剂盒的外、内下游锚定引物，利用槽式降落PCR扩增3’ UTR区片段。引物序列如下:
[0037]外引物的上游引物:5’-CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC-3’(序列表SEQ ID NO:I)
[0038]外引物的下游引物:5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3 ’
[0039]内引物的上游引物:5’-GCCTGAAAGCAGATGAAACGGA-3’(序列表SEQ ID NO:2)
[0040]内引物的下游引物:5’ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 ’
[0041 ] 1.2猪组织总RNA提取与检测
[0042]使用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取湖北白猪(湖北省农业科学院畜牧兽医研究所实验猪场)肝脏组织总RNA，具体提取步骤参照Trizol试剂自带说明书。溶解后的RNA在含有溴化乙锭(EB)的1.2%琼脂糖胶上电泳检测，同时在DNA浓度测定仪上测定浓度，存放于_20°C备用。
[0043]1.3反转录
[0044]以总RNA为模板，使用宝生物工程大连有限公司的3’ RACE Adaptor引物进行反转录反应，合成cDNA第一链。反应体系(10μ I)为:总RNA (500ng/y 1)1μ 1，3^ RACE接头引物(5 μ Μ) I μ 1，5XPrimeScript 缓冲液 2 μ l，dNTP 混合液(IOmM) I μ 1，RNA 酶抑制剂(40U/ μ I) 0.25 μ I，PrimeScript 反转录酶(200U/ μ I) 0.25 μ I，无 RNA 酶 dH204.5 μ I。
[0045]反应程序为:42°C，60min;70°C，15min。
[0046]1.3槽式PCR扩增
[0047]进行第一轮外引物PCR扩增反应体系(50μ I)为:反转录cDNA2y 1，1XcDNA稀释缓冲液118 μ 1，RACE外引物的上游引物(10 μ Μ) 2 μ 1，外引物的下游引物(10 μ M) 2ul，10 X TransStart? Taq 缓冲液(含 Mg2+) 7 μ I，TransStart? Taq 酶(2.5U/ μ I) 0.5 μ I，ddH2028.5 μ I。反应程序为:95°C预热4min ;95°C变性30s，62°C _52°C退火30s(每个循环降低 0.5°C )，72°C延伸 1.5min,共 20 个循环；95°C变性 30s, 52°C退火 30s, 72°C延伸 1.5min,共15个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0048]进行第二轮内引物PCR扩增反应体系(50 μ I)为--第I轮PCR产物Iul，dNTP混合液(2.5mM) 8 μ 1,10XTransStart? Taq 缓冲液(含 Mg2+) 10 μ 1，RACE 内引物的上游引物(ΙΟμΜ) 2μ 1，内引物的下游引物(ΙΟμΜ) 2ul，TransStart? Taq 酶(2.5U/μ I) I μ 1，ddH2026 μ I。反应程序为:95°C预热4min ;95°C变性30s，64°C _54°C退火30s (每个循环降低 0.5°C )，72°C延伸 1.5min,共 20 个循环；95°C变性 30s, 54°C退火 30s, 72°C延伸 1.5min,共15个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果见图2所示。从琼脂糖回收目的DNA，送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。在NM_213976.1已知的mRNA序列基础上向下游延伸获得包含PolyA特征的3’ UTR核苷酸序列(见序列表SEQ ID NO:3所不)。
[0049]2构建猪CD163-3’ UTR荧光素酶报告载体
[0050]2.1生物信息学预测调控猪⑶163基因3’ UTR的miRNA及靶点
[0051]利用生物信息学工具TargenScan，参考人3’UTR序列，预测调控⑶163基因表达的、物种间保守miRNAs (miR-181a, b, c, d、miR-23a, b, c等)及其作用靶位点序列(TGAATGT和AATGTGA),详见 http://www.targetscan.0rg/cg1-bin/targetscan/vert_61/view_gene.cgi ? taxid=9606&rs=NM_203416&member s=&showcnc=0&shownc=0&showncf=。对比新扩增获得的猪3’UTR区序列，发现也包含这些保守miRNAs的靶位点序列(TGAATGT和AATGTGA)。
[0052]2.2扩增猪CD1633’ URT片段及纯化
[0053]结合猪⑶163基因⑶S序列和以上测序结果，设计包含3’ UTR区的一对引物，PCR扩增猪⑶163基因3’UTR469bp片段,所用引物为:上游引物:5’ CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC3’(序列表SEQ ID NO:4)，含有XhoI (CTCGAG)酶切位点和保护碱基(CCG);下游引物:5’ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG3’(序列表 SEQ ID NO:5)，含有 NotI (GCGGCCGC)酶切识别位点和保护碱基(ATTT)。
[0054]PCR扩增反应体系(总体积50 μ I)为:反转录cDNAl μ 1，10XTransStart? Taq缓冲液(含 Mg2+) 10 μ 1，dNTP 混合液(2.5πιΜ)8μ 1，上游引物(10μΜ)2μ 1，下游引物(ΙΟμΜ)2ul, TransStart? Taq 酶(2.5U/μ I)1 μ 1，ddH2026 μ I。反应程序为:95°C预热 4min ;95°C变性30s, 55°C退火30s, 72°C延伸1.5min, 5个循环；95°C变性30s，60。。退火30s, 72°C延伸
1.5min，共25个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0055]PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测(图3)，采用过柱离心的方法从琼脂糖回收纯化PCR产物，并送测序验证(序列表SEQ ID NO:6)0
[0056]2.3 载体 ps1-CHECK2 扩增
[0057]载体ps1-CHECK2同时含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶基因(图4)，其中萤火虫荧光素酶基因为内参基因，海肾荧光素酶基因为检测的报告基因。经过大肠杆菌DH5CI扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.? Endo-Free PlasmidMini KitISpin)进行抽提载体DNA,具体步骤见试剂盒说明书。
[0058]2.4双酶切
[0059]由2.3中抽提的载体psi_CHECK2DNA和2.2中回收纯化的PCR产物，分别用XhoI和NotI限制性内切酶进行双酶切，所用内切酶均购自宝生物工程大连有限公司。载体酶切体系如下:载体口8卜0^0(21(^1，10\!1缓冲液4 4 1，BSA4y I, Xho I限制性内切酶
2μ I, Not I限制性内切酶2 μ 1，ddH2018y 1，共40μ I。PCR产物酶切体系如下:PCR产物20μ 1，10XH缓冲液4μ l，BSA4y l，Xho I限制性内切酶2 μ 1，Not I限制性内切酶2 μ 1，ddH208 μ 1，共 40μ I。
[0060]混合体系于37°C酶切过夜。酶切产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收。
[0061]2.5 连接
[0062]将酶切后纯化的载体psi_CHECK2和⑶163基因3’ UTR切割片段，用T4连接酶进行连接。连接体系为:ps1-CHECK2载体2μ 1，⑶163基因3，UTR扩增片段6 μ 1，Τ4连接酶1μ 1，10XT4DNA连接酶缓冲液1μ 1，共10 μ I。混合体系于4°C连接过夜。
[0063]2.6转化感受态细胞
[0064]将连接产物转化至大肠杆菌DH5 α感受态中，具体步骤如下:
[0065](I)向50 μ I感受态细胞中加入5μ I的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min ；
[0066](2) 42°C热激60s，立即冰上放置2min ；[0067](3)加入400 μ I无氨苄的LB液体培养基，放入37°C恒温摇床中复苏60min ；
[0068](4)以4000rpm/min离心4min,去除300 μ I上清,将剩余的上清吹散细菌沉淀,并将他们均匀涂抹在含有100μ g/ml氨苄的LB固体培养基平板中；
[0069](5)371:正置培养601^11 (待菌液完全吸收)后，倒置培养14_16h，观察有无白色菌落长出。
[0070]2.7筛选阳性克隆并测序验证
[0071]用灭菌枪头从平板中挑取单克隆接入500 μ I含氨苄的LB液体培养基中，于37°C恒温摇床扩大培养6h。以菌液为模板，用2.2中引物和PCR反应条件检测，有目的条带的说明该克隆为阳性克隆，将阳性克隆菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序正确的阳性克隆用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.? Endo-FreePlasmid Mini KitISpin)抽提重组载体DNA并测定浓度,具体步骤参见试剂盒说明书。同时，用XhoI和NotI限制性内切酶进行双酶 切该载体，再次验证插入片段正确性(图6)。 申请人:将该载体命名为ps1-CHECK2-CD163-3UTR，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。。
[0072]3猪⑶163-3’ UTR荧光素酶报告载体的应用
[0073]3.1人工合成候选miRNAs
[0074]人工合成miR-181c、miR_181d、miR_23a 和 miR-4262 (预测可调控 CD163 基因表达的候选miRNAs)模拟物，及NC阴性对照。以上miRNAs及NC对照均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
[0075]3.2 利用 ps1-CHECK2-CD163-3UTR 载体与 miRNAs 共转染 Marc-145 细胞
[0076](I)在转染前一天，5 X IO4细胞接种在24孔板中，加入无抗生素的培养基培养细胞；
[0077](2)将每孔加入200ng ps1-CHECK2-CD163_3UTR载体、各miRNA模拟物(使终浓至80nM)溶于50ul Opt1-MEM无血清培养基中，室温静置5min ；
[0078](3)每孔加入 2ul LipofectaminTM2000 脂质体(购自 Invitrogen 公司)溶于 50ulOpt1-MEM无血清培养基中，室温静置5min ；
[0079](4)将步骤(2)和(3)的液体混合,室温静置30min,然后均匀加入代转染细胞中；
[0080](5)将细胞培养板放入无菌5%C02培养箱中，培养5h后，更换为新鲜完全培养基，48h后收集细胞。
[0081]每组均做3孔生物学重复。
[0082]3.3双荧光素酶活性检测
[0083]转染48h后，用磷酸盐缓冲液(简称PBS，购自HyClone公司)清洗细胞2次，加入120ul细胞裂解液I X PLB，室温摇晃15min充分裂解细胞，然后将裂解液收集至1.5ml离心管中，按照Promega公司的双突光素酶检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay)说明书提供的方法，采用PerkinElmer公司的VICTOR? X2Multilabel Plate Reader仪器检测双荧光素酶活性。萤火虫荧光值(Ml)为内参荧光值，海肾荧光值(M2)为报告基因检测值，结果以M2/M1比值计算，利用SPSS17.0对检测结果进行统计分析，结果见表1。以NC对照为参照，相对荧光活性检测结果如图7所示。结果可以看出，相对于NC对照而言，miR-lSlc(66%)、miR-181d (54%)、miR_23b (69%)和 miR-4262 (59%)均可在显著抑制猪 CD163 基因表达，其中miR-181d抑制效果最佳，其活性仅为NC对照组的54%。[0084]表1.双荧光素酶相对活性检测结果
【权利要求】
1.一种基于猪⑶163基因的双荧光素酶报告基因载体ps1-CHECK2-⑶163-3UTR，其特征在于:该载体包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，该序列位于猪⑶163基因的3’UTR区。
2.—种扩增猪⑶163基因cDNA3’末端的上游引物，其特征在于:所述引物的DNA序列如下所示: 外引物:CAGGTCGCTCATCTTTTGTTGC, 内引物:GCCTGAAAGCAGATGAAACGGA。
3.—种扩增猪CD163基因469bp片段的引物对，其特征在于:所述引物对的DNA序列如下所示: 上游引物:CCGCTCGAGTCGCTCATCTTTTGTTGC， 下游引物:ATTTGCGGCCGCTTTTATTTAATGCCCTTG。
4.一种用于非诊断目的的基于猪CD163基因的双荧光素酶报告基因载体ps1-CHECK2-⑶163-3UTR的制备方法，其特征在于:该载体通过以下步骤制备得到: (1)参考猪⑶163基因cDNA序列，利用cDNA3’末端快速扩增结合槽式降落PCR克隆获得猪⑶163基因完整3’ UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示； (2)利用生物信息学工具T argenScan，预测调控猪⑶163基因表达的物种间保守microRNAs及靶位点序列，对比扩增的猪3’UTR区序列，寻找包含保守microRNAs的靶位点序列 TGAATGT 和 AATGTGA ； (3)结合猪⑶163基因⑶S和SEQID NO:3所示核苷酸序列，设计包含microRNAs的靶位点序列的一对引物，该引物对的DNA序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，利用PCR扩增猪⑶163基因，得到如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，其长度为469bp ； (4)将步骤(3)扩增的序列插入双荧光素酶报告基因载体ps1-CHECK2中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒DNA并做双酶切鉴定，获得猪CD163基因双荧光素酶报告基因载体ps1-CHECK2-CD163-3UTR，其核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示。
【文档编号】C12N15/66GK103468730SQ201310384901
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月29日 优先权日:2013年8月29日
【发明者】吴俊静, 梅书棋, 彭先文, 乔木, 武华玉, 刘贵生, 宋忠旭, 孙华, 李良华, 李明波, 董斌科 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所