海带配子体lhcf6基因启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及海带配子体lhcf6基因启动子及其应用，具体提供了海带配子体lhcf6基因启动子序列、该启动子序列在启动藻类表达目的基因中的用途、含有该启动子序列的重组载体，以及基于该启动子序列制备转基因藻类的方法。通过将克隆得到的海带配子体lhcf6基因启动子连接入融合表达载体，电击转化法转化莱茵衣藻，证实该启动子驱动目的基因表达的效率与（CaMV）35S启动子几乎相当，为进一步分析lhcf6基因在雌、雄配子体中差异表达机理奠定了基础，同时为人为调控藻类相关基因的表达提供了条件，且该启动子来源于海带，生物安全性强。
【专利说明】海带配子体Ihc代基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体地说，涉及海带配子体7Ac/6基因启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]光捕获蛋白复合体(light-harvestingprotein complex, LHC)是一类镶嵌于藻类及高等植物类囊体膜上以结合天线或辅助色素并为光合作用反应中心捕获与传递光能的蛋白。在适宜的光照强度下，藻类的LHC起着结合色素并将色素捕获的光能传递并分配至光反应中心以进行光合作用；当光照强度超过光合作用所需的最大光通量时，藻类细胞通过调整LHC基因表达量，降低类囊体膜上结合的色素并减少光能的传递，以保护叶绿体避免光抑制所导致的不可修复性损伤；但在光照强度过弱或营养不足等胁迫条件下，增加类囊体膜上光合作用复合体中一些捕光蛋白的量，更有效地参与光能的捕获、传递与忙藏以及其他未知功能以适应变化的环境。据报道,糖海带(feccAarifla Iatissima)氣藻素-叶绿素a/c结合的光捕获蛋白(LHCF)复合体是由7个成员所构成的蛋白家族，经同源序列比对，海带(5: 就属于该家族中的一员。经实时荧光定量PCR(Q-RT-PCR)检测，发现海带在不同光强、光质等条件下甚至在雌、雄配子体之间都存在转录量的差异。
[0003]高等植物LHCA-1和LHCB-1基因的表达主要受转录水平的调控，而启动子是该调控的一个重要元件。同一藻体不同的表达量可能是由于光捕获蛋白基因启动子的多样性造成的。克隆7Ac/6启动子并鉴定其功能将为进一步分析7Ac/6基因在海带雌、雄配子体中差异表达的机理奠定基础，对启动子加以改造则为人为调控相关基因的表达提供条件。
[0004]中国期刊《高技术通讯》2008年01期刊出了论文“海带配子体叶绿素a/c结合蛋白基因Ihcfb的序列特征与系统发生分析”,该论文根据糖海带(5: Iatissima)叶绿素a/c结合蛋白基因Ihcfb的cDNA序列设计引物和PCR方法获得了海带(5: japonica、配子体Ihcm基因的cDNA全长序列，证实该序列的开放阅读框(ORF)与糖海带Ihcfb编码序列的相似性高达99%，而两非翻译区(UTR)序列的相似性只有94%，并进一步推测了海带配子体基因编码的蛋白序列及其结构，与同源蛋白质的氨基酸序列比对，构建了Neighbor-joining分子进化树，阐明了藻类在光捕获蛋白氨基酸序列水平上存在着蓝藻与红藻、杂色藻类、裸藻与绿藻等三个方向的演化途径，其中裸藻和绿藻与高等植物的亲缘关系更近。但是目前关于海带(5:配子体基因启动子的序列还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的多核苷酸。
[0006]本发明的再一的目的是，提供上述分离的多核苷酸的用途。[0007]本发明的另一的目的是，提供一种重组载体。
[0008]本发明的第四个目的是，提供一种制备转基因藻类的方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸选自下列中的一种:
a)由SEQID N0.7或SEQ ID N0.8所示的序列构成的核苷酸序列；或
b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0010]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
如上所述的多核苷酸在启动藻类表达目的基因中的用途。
[0011]所述的藻类可以是莱茵衣藻(C reinhardtii)资海荀is.japonica) 0
[0012]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种重组载体，所述的重组载体含有如上所述的多核苷酸，该多核苷酸是作为启动子元件。
[0013]所述的重组载体还可以进一步含有与所述的多核苷酸可操作地连接的目的基因。
[0014]作为本发明的一个实施例，所述的重组载体是通过以下方法构建的:
a)用I和AfcoI双酶切pCAMBIA1304双元表达载体，获得大片段；
b)使如上所述的多核苷酸的序列两端连接上I和Afc0I酶切识别位点并用Pst 1.和
Afco I双酶切，回收目的片段；
c)将步骤a)的大片段与步骤b)的目的片段连接、验证、提取质粒，获得所述的重组载体。
[0015]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种制备转基因藻类的方法，所述的方法包括下列步骤:
a)提供含有作为启动子元件的如上所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物；
b)将所述构建物导入藻类细胞；
c)筛选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的藻类细胞。
[0016]所述的藻类可以是莱茵衣藻(C reinhardtii)资海荀{S.japonica) 0
[0017]本发明优点在于:
通过基因组步移(genome walking)技术克隆7Ac/6基因在雌、雄配子体中的5’ -侧翼片段，再通过网络服务器进行调控元件在线预测之后，将其与绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein, GFP)报告基因一起构建成融合表达载体,通过电击转化法转化莱茵衣藻(C激光共聚焦荧光显微镜下检测，以鉴定所克隆得到的雌、雄配子体
Ihcm的5’-侧翼片段的启动子活性，证实该启动子驱动目的基因表达的效率与(CaMV)35S启动子几乎相当，为进一步分析基因在雌、雄配子体中差异表达机理奠定了基础，同时为人为调控藻类相关基因的表达提供了条件，且该启动子来源于海带，生物安全性强。
【专利附图】
【附图说明】[0018]附图1是pMD19T载体图谱。
[0019]附图2是pCAMBIA1304双元表达载体图谱。
[0020]附图3是基因步移第二次PCR扩增结果电泳图。电泳图谱右侧泳道的M为DL 2000分子量标准，电泳图谱左边泳道的F和M分别代表雌、雄海带配子体基因5’-侧翼片段，长度分别为895 bp和865 bp。
[0021]附图4是激光共聚焦显微镜检测转化了 pCAMBIA1304_F7Ac/6、pCAMBIA1304-M/Ac/6和pCAMBIA1304双元表达空质粒的莱茵衣藻细胞中绿色荧光信号结果。其中，编号A1-A4为转入质粒pCAMBIA1304-WAc/6的莱茵衣藻细胞，B1-B4为转入质粒pCAMBIA1304-l/Ac/6的莱茵衣藻细胞，C1-C4为转入pCAMBIA1304双元表达空质粒的莱茵衣藻细胞；1为485 nm激发光下检测GFP的绿色荧光信号图；2为650nm激发光下检测细胞内叶绿体自发红光荧光信号图；3为整合图；4为明场图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0023]实施例1
1、材料
I)海带(5:雌、雄配子体取自本实验室。在温度为17°C、光照强度为40
V- mo I.π 2.8'光/暗比为16h/8h的条件下培养,培养基为PES,具体配方参见文献:StarrRC, Zeikus JA (1993) UTEX-The culture collection of algae at the University ofTexas at Austin.J Phycol 29 (Suppl): 1-106。
[0024]2)莱茵衣藻(C为细胞壁缺失突变株CC-3491，购自美国杜克大学衣藻中心(Chlamydomonas Center)。在温度为25°C、光照强度为70 μ mo I.m2.s'光/暗比为12h/12h的条件下培养，培养基为TAP，具体配方参见文献:Harris，E.H.(1989):The Chlamydomonas sourcebook: a comprehensive guide to biology and laboratoryuse.Academic Press, San Diego, 780ppo
[0025]2、方法
I)利用UNIQ-10植物基因组抽提试剂盒(购于Tiangen公司)分别提取海带雌、雄配子体基因组DNA，保存于_20°C备用。
[0026]2)基于海带Ihcih的cDNA全长序列(GenBank登录号:DQ250739)，设计基因特异引物 GSPl (SEQ ID N0.1^GSP2 (SEQ ID N0.2)，分别与 Genome Walker 试剂盒(购于Clontech公司)中接头引物APl和AP2配对用于一次和二次PCR扩增，接头引物APl和AP2序列参见试剂盒说明书，GSPl和GSP2序列如下:
【权利要求】
1.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述的多核苷酸选自下列中的一种: a)由SEQID N0.7或SEQ ID N0.8所示的序列构成的核苷酸序列；或 b)与a)中所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的多核苷酸在启动藻类表达目的基因中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的藻类是莱茵衣藻reinhardtiiSaccharina japonica ο
4.一种重组载体，其特征在于，所述的重组载体含有如权利要求1所述的多核苷酸，作为启动子元件。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体还含有与所述的多核苷酸可操作地连接的目的基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体是通过以下方法构建的: a)用PstI和I双酶切pCAMBIA1304双元表达载体，获得大片段； b)使权利要求1所述的多核苷酸的序列两端连接上I和Afc0I酶切识别位点并用 I和Nco I双酶切，回收目的片段； c)将步骤a)的大片段与步骤b)的目的片段连接、验证、提取质粒，获得所述的重组载体。`
7.一种制备转基因藻类的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤: a)提供含有作为启动子元件的如权利要求1所述的多核苷酸以及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物； b)将所述构建物导入藻类细胞； c)筛选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的藻类细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的藻类是莱茵衣藻Creinhardtii或海带 51 japonica。
【文档编号】C12N15/113GK103497951SQ201310398851
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】毕燕会, 宁璞, 周志刚 申请人:上海海洋大学