肺癌易感基因的单核苷酸多态性位点rs7975232的检测方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学和医学领域，涉及一种检测肺癌易感性基因的方法及其检测试剂盒。本发明提供了一种检测原发性支气管肺癌易感性基因的方法，它包括检测维生素D受体基因（VDR）多态性位点rs7975232位点的基因型，rs7975232带有C基因型的个体，肺癌的易感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒含有扩增rs7975232位点的引物，还可以包括扩增VDR基因启动子内包含rs7975232位点的区域的引物。利用本发明检测rs7975232位点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为肺癌的诊断和治疗提供有意义的参考数据。
【专利说明】肺癌易感基因的单核苷酸多态性位点rs7975232的检测方 法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和医学领域。更具体地，涉及人维生素 D受体基因 （VDR gene)的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)位点 rs7975232 及其与 原发性支气管肺癌相关性的检测。本发明还涉及检测这个SNP位点的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 研究显示，肺癌（lung cancer)是一种多因素、多基因疾病，由环境与遗传因素共 同致病的常见而多发的恶性肿瘤，对人类健康造成了极大的影响。随着分子医学的发展， 目前已经发现了大量的肺癌相关基因，但是肺癌的发病机制仍然不完全清楚，肺癌的早期 诊断和预防问题仍然未能完全解决。肺癌是遗传因子和环境共同作用的结果，由于环境因 素(如吸烟、大气污染）是可以控制和确认的，而对肺癌遗传学因素却是固定不变的。因此， 对可变因素的控制，如对肺癌危险因素的预防，可以在一定程度上延缓和防止肺癌的发病， 但是对固定不变的遗传因素的认识不足却在一定程度上严重影响着对肺癌发病、诊断和治 疗。因此对肺癌遗传学的研究十分必要（Alberg AJ, Brock MV, Samet JM. Epidemiology of lung cancer:looking to the future[J]. J Clin Oncol. 2005;23:3175-3185)。
[0003] 近年来，有关肺癌治疗的研究更多地集中在肺癌的治疗领域，在肺癌化疗、靶向治 疗方面国内外已取得突飞猛进的发展。但是，这些手段并不能从根本上控制肺癌发病；目 前对人类肺癌驱动基因的研究虽有一定进展，但仍十分有限。因此，从肺癌发病相关基因入 手，研究肺癌发病机制是今后肺癌防治研究的主要方向之一，具有重要的研究价值和应用 前景，如果通过调节内源性抑癌机制治疗肺癌，将会促进我国生物医疗技术的发展，并为我 国每年节省巨大的医疗费用。
[0004] 大量针对肺癌的基础研究显示，维生素 D与抑制肿瘤细胞增殖、抗新生血管形成、 抑制肿瘤转移、诱导细胞凋亡等多种机制相关。人类VDR基因定位于12ql2_14,包含11个外 显子。在人体代谢通路中，维生素 D的活化形式1，25 (OH) 2D3通过与维生素 D受体（VDR)结合 而发挥生物学效应，因此VDR的表达决定了 1，25 (OH) 2D3能否有效发挥作用，故VDR基因被 认为可能与肺癌发病相关(李榕，韩宝惠.维生素 D与肺癌[J].肿瘤，2010 ;30 :443-446)。 rs7975232位点是VDR基因常见的酶切位点，但与肺癌发病风险的相关性研究较少，没有证 实rs7975232与肺癌发病风险具有相关性的报道。
[0005] 综上所述，为了最终实现治疗肺癌，本领域迫切需要寻求原发性支气管肺癌易感 基因，并开发检测原发性支气管肺癌易感基因的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测(包括早期诊断）肺癌易感基因单核苷酸多态性位 点的方法及检测试剂盒。
[0007] 本发明提供了一种肺癌易感性基因单核苷酸多态性位点的检测方法，即检测VDR 基因 rs7975232位点的基因型，rs7975232带有C基因型的个体肺癌的发病风险显著高于 普通人群。
[0008] 所述的rs7975232,位于VDR的启动子中（片段重叠群contig :NT_029419. 12位置 10382143C/A)其中，脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：rs7975232位置基于SEQ ID NO :1/6 ; 引物1基于SEQ ID NO :2/6 ;引物2基于SEQ ID NO :3/6 ;探针1基于SEQ ID NO :4/6 ;探 针2基于SEQ ID NO :5/6 ;扩增产物基于SEQ ID NO :6/6。
[0009] 具体而言，该方法包括步骤：（a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得VDR基因启动 子；(b)检测步骤（a)产物中单核苷酸多态性位点rs7975232的基因型。
[0010] 所述的扩增VDR基因启动子的引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0011] 所述的检测rs7975232的基因型的探针序列如SEQ ID N04和SEQ ID N05所示。
[0012] 上述方法中涉及的测序、扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操 作方法。
[0013] 本发明提供了一种检测肺癌易感基因的试剂盒，它含有与位点rS7975232结合的 探针。
[0014] 在本发明的一个实施例中，与位点rs7975232结合的探针的序列如SEQ ID N0:4 和 SEQ ID NO : 5 所示。
[0015] 上述试剂盒还可以包括特异性扩增VDR基因启动子中包含rs7975232位点的区域 的引物。
[0016] 在本发明的一个实施例中，与特异性扩增VDR基因启动子中包含rs7975232位点 的区域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
[0017] 本发明经过多年研究，首次证明了 VDR基因单核苷酸多态性位点rs7975232(位于 VDR启动子中，片段重叠群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)与肺癌密切相关，而 且发现了它的新功能=VDR基因单核苷酸多态性位点rs7975232位于VDR，启动子中（片段重 叠群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)基因型的改变将导致肺癌的发病风险升高， 其中关联研究结果显示，在VDR基因 rs7975232A - C在病例和对照组中的分布存在显著性 差异（p〈0. 05)，该SNP多态性可改变转录因子结合位点。在此基础上完成了本发明。
[0018] 本发明提供了一种对个体的肺癌易感性进行判断的方法，它包括步骤：检测该个 体的VDR基因 rs7975232位点的基因型，以此判断该个体患肺癌的发病风险是否高于普通 人群。
[0019] 在一优选例中，所述的差异是选自rs7975232的单核苷酸多态性。rs7975232位 于VDR，启动子中（片段重叠群contig :NT_029419. 12位置10382143C/A)。其中，脱氧核糖 核酸（DNA)序列编号：rs7975232位置基于SEQ ID NO :1/6。
[0020] 本发明提供了一种检测样品是否存在VDR基因的单核苷酸多态性的方法，包括步 骤：
[0021] (a)用VDR基因启动子特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和
[0022] (b)检测扩增产物中单核苷酸多态性位点rs7975232的基因型。
[0023] VDR基因的详细序列可参见登录号为rs7975232的核苷酸序列（可参见网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
[0024] 本发明人对VDR基因中的启动子中（片段重叠群contig :NT_029419. 12位置 10382143C/A)区域进行了测序。
[0025] VDR基因 rs7975232位点的多态性可直接用于肺癌的个性化治疗。在使用本发明 VDR基因 rs7975232位点的多态性时，还可同时使用其他治疗肺癌的药剂。
[0026] 本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效的本发明VDR蛋白以及药学上 可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙 醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶 囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊在 无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天〇. 1微克/千克体重-约10 毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0027] 使用所述的药物组合物时，是将安全有效量的VDR蛋白或其拮抗剂、激动剂施用 于普哺乳动物，其中该安全有效剂量通常至少约〇. 1微克/千克体重，而且在大多数情况下 不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0. 1微克/千克体重-约100毫克/千克 体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范 围之内。
[0028] 检测VDR基因的rs7975232的基因型可为进一步诊断肺癌提供有意乂的参考数 据。检测可以针对基因组DNA，也可针对VDR基因的扩增片段。VDR基因的rs7975232的基 因型可采用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。
[0029] 本发明提供了一种检测原发性支气管肺癌易感性基因的方法，它包括检测维生素 D受体基因（VDR)的rs7975232位点的基因型，rs7975232带有C基因型的个体，肺癌的易 感性显著高于普通人群。本发明还公开了相应的检测试剂盒,该试剂盒含有扩增rs7975232 位点的引物，还可以包括扩增VDR基因启动子区域的引物。利用本发明检测rs7975232位 点的基因型，方法简单易行，快速高效，成本低廉，为提供简捷的肺癌的诊治新途径提供有 意义的参考数据。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1是VDR基因 rs7975232位点基因型的检测结果。
[0031] 图2是测序结果截图，显示了 rs7975232的一种SNP基因型的测序结果，其中， rs7975232 位于 VDR，启动子中（片段重叠群 contig :NT_029419. 12 位置 10382143C/A)。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆；实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0033] 实施例1 荧光PCR检测
[0034] 一、实验材料
[0035] 7900HT荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，聚合酶链反应液（TaqMan EXPress Master Mix)由美国应用生物系统公司（ABI)定制合成。
[0036] 二、引物及探针设计与合成：
[0037] 以VDR基因启动子的部分序列为模板，使用Primer ExpreSSTM2.0软件分析 TaqMan引物和探针位点，并由美国应用生物系统公司（ABI)定制合成。
[0038] 检测用引物：
[0039] VDR基因 rs7975232 上游引物序列：5 ' -TGTACGTCTGCAGTGTGTTGGAC-3 '（SEQ ID N02)
[0040] VDR 基因 rs7975232 下游引物序列：5 ' -AGGTCTGGATCCTAAATGCACG-3 ' (SEQ ID N03)
[0041] 荧光探针：
[0042] VDR 基因 rs7975232 荧光探针 I :5 ' -VIC-AGCTGGGCACCTCACTGC-TAMRA-3 ' (SEQ ID N04)
[0043] VDR 基因 rs7975232 荧光探针 2 :5 ' -FAM-AGCTGGGCCCCTCACTGC-TAMRA-3 ' (SEQ ID N05)
[0044] 三、样本检测：
[0045] 实验共检测72例肺癌病例和67例正常对照人群，每例收集血样标本约2ml，用酚 /氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（INFINIGEN公司）检测。
[0046] 按如下体系进行荧光PCR扩增，最后用SDS2. 3扫描并聚类分析
[0047]
【权利要求】
1. 一种肺癌易感性基因的检测方法，其特征在于，检测VDR基因 rs7975232位点的基因 型，rs7975232带有C基因型的个体肺癌的发病风险显著高于普通人群。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，rs7975232位点位于VDR基因启动子 内。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，该方法包括步骤： (a) 抽提样品的基因组DNA，扩增获得VDR基因启动子中包含rs7975232位点的区域； (b) 检测步骤（a)产物中单核苷酸多态性位点rs7975232的基因型。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，扩增VDR基因启动子中包含rs7975232 位点的区域的引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
5. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，检测rs7975232的基因型的探针序列如 SEQ ID N04 和 SEQ ID N05 所示。
6. -种检测肺癌易感基因的试剂盒，其特征在于，它含有与位点rs7975232结合的探 针。
7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，与位点rs7975232结合的探针的序列如 SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5 所示。
8. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它还包括特异性扩增VDR基因启动子中包 含rs7975232位点的区域的引物。
9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，特异性扩增VD R基因启动子中包含 rs7975232位点的区域的引物的序列如SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3所示。
【文档编号】C12Q1/68GK104419759SQ201310401408
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】韩宝惠, 李榕, 楼煜清, 张岩巍, 李营 申请人:上海市胸科医院