一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella?sp.)Lzh-2，保藏号为CGMCC?No.6549，并且从其代谢产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮，其中六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为5.7μg/mL，对聚球藻BN60无致死效果，二氢吲哚-2,3-二酮对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的半致死量LD50分别为12.5μg/mL和34.2μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
【专利说明】一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2及其在蓝藻水华控制中的应用。
【背景技术】
[0002]近些年来湖泊富营养化导致的蓝藻水华爆发对湖泊水系的污染日益严重，太湖、巢湖、滇池等淡水水域都受到了严重的影响。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。
[0003]蓝藻水华的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法如机械除藻、电磁场除藻等可以作为水华爆发的辅助控制措施，但是缺点在于治标不治本，并且处理能力有限；化学方法如除草剂等化学杀藻剂可以直接杀死藻类，但这些化学物质的专一性差，而且容易富集在食物链中造成二次污染。
[0004]其中由于物理方法和化学方法存在上述缺陷，生物方法因其环保、经济等优点，受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌(algae-lysing bacteria)是一类可以直接(菌藻细胞接触)或者间接(分泌胞外物质)抑制灭杀蓝藻的细菌统称，它们是淡水生态环境系统的重要组成部分，对减少蓝藻的生物量，维持生态平衡具有重要作用。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理能力有限、容易造成二次污染的缺陷，本发所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细`菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌及其代谢产物在蓝藻水华控制中的应用。
[0008]本发明公开了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.6549，保藏日期为2012年9月14日。保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101,电话:86-10-64807355。
[0009]进一步地，本发明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2在控制蓝藻水华中的应用。
[0010]进一步地，本发明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
[0011]进一步地，本发明公开了上述希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物中两种具有溶藻活性的有效成分，分别为具有结构式(I)和(II)所示结构的化合物，本发明提供了一种具有结构式(I)所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。
[0012]οO
0
Oh
(I)(II)
[0013]进一步地，本发明提供了一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求I所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2?
[0014]进一步地，本发明提供了 一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求I所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
[0015]进一步地，本发明提供了一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤:
[0016]I)、发酵希瓦氏菌Lzh-2菌株；
[0017]2)、萃取发酵液；
[0018]3)、萃取液蒸干得粗提物；
[0019]4)、粗提物水溶后用于控制蓝藻水华。
[0020]优选地，步骤I)中，发酵条件为，希瓦氏菌Lzh-2接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、200rpm环境条件下发酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh_2发酵液。
[0021]优选地，步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即希瓦氏菌Lzh-2发酵液的萃取液。萃取液蒸干后即为发酵液粗提物。粗提物经本领域常规技术手段，如柱层析的方法，进一步提纯即可得到发酵液提取物，发酵液提取物可以为单一成分，也可以为包括多种组分的组合物。
[0022]所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液对下列藻株的4天溶藻率分别为:衣藻BS3为91.7±7.8%，绿藻BI为86±12.1%，铜绿微囊藻PCC7806为79±4.1%，铜绿微囊藻9110为 77.3 ±3.4%,颤藻 BN35 为 74.1 ±4.5%,绿色微囊藻 FACHB-979 为 72.6 ±5.7%,聚球藻BN60为43±5.8%，色球藻FACHB-191为34.1 ±6.9% ；6天溶藻率分别为:衣藻BS3为93.1 ±7.3%，绿藻 BI 为 97.9±6.2%，铜绿微囊藻 PCC7806 为 84.9±3.8%，铜绿微囊藻 9110为 92.3±6.8%，颤藻 BN35 为 97.2±10.5%，绿色微囊藻 FACHB-979 为 86.3±8.5%，聚球藻BN60 为 81.9±3.9%，色球藻 FACHB-191 为 29.5±9.7%。
[0023]所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液，利用HPLC技术纯化希瓦氏菌Lzh_2的代谢产物，具体制备方法如下:
[0024]将所述萃取液蒸干并加水溶解后使用0.22 μ m孔径滤膜过滤，滤液通过DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制备柱，水和甲醇为流动相的HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；
[0025]将所述溶藻成分通过DIKMA SupersilTM C18-EP分析柱，水和甲醇为流动相的HPLC进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-2A和S-2B。
[0026]所述的希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过LC-MS、GC-MG和HMR分析获得。
[0027]希瓦氏菌Lzh-2用于控制蓝藻水华时，其有效的溶藻成分S-2A的分子离子峰为155.0821m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C7HltlN2O2，核磁共振氢谱结果是1HNMR (400MHz, D2O) δ 4.22 (s, I H)，4.06 (dd, J=17.3，2.7Hz, 1H)，3.77 (d, J=17.3Hz, 1H)，3.44(dd, J=8.7，4.8Hz，2H), 2.41 - 2.12 (m, 1H) ,2.09-1.71 (m, 3H);有效的溶藻成分 S-2B 的分子尚子峰为146.0250m/z,样品分子量为147.1308,分子式为C8H5NO2,核磁共振氢谱结果是1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 8.11 (s, 1H)，7.76 (d, J=7.5Hz, 1H)，7.70 (s, 1H)，7.26 (t, J=7.6Hz,1H)，7.05 (d, J=7.9Hz, 1H)。
[0028]进一步地，有效的溶藻成分S-2A是所述希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物六氢吡咯并[I, 2-A]吡嗪-1，4- 二酮，有效的溶藻成分S-2B是所述希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物二氢吲哚-2，3-二酮。
[0029]进一步地，六氢吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4- 二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为5.7 μ g/mL ;所述二氢吲哚_2，3- 二酮(靛红)对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为12.5 μ g/mL,对聚球藻BN60的半致死量LD50为34.2 μ g/mL。
[0030]本发明的希瓦氏菌Lzh-2的溶藻效果具有广谱性。其发酵液制备方法简单，制备周期短。希瓦氏菌Lzh-2的发酵液对太湖中的铜绿微囊藻9110、聚球藻BN60、绿藻B1、颤藻BN35等具有很好的溶藻效果，而铜绿微囊藻和聚球藻是太湖蓝藻水华中的主要蓝藻。希瓦氏菌Lzh-2发酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制，且溶藻效果较好。其中，希瓦氏菌Lzh-2发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率达到92.3±6.8%，对聚球藻BN60的6天溶藻率达到81.9 ±3.9%。希瓦氏菌Lzh_2的代谢产物六氢吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4-二酮和二氢吲哚-2，3-二酮(靛红)对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60具有较好的致死作用`，可用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。
[0031]以下将结合附图对本发明的希瓦氏菌Lzh-2菌株及其代谢产物六氢吡咯并[I, 2-A]吡嗪-1，4- 二酮和二氢吲哚_2，3- 二酮(靛红)在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是溶藻菌Lzh-2对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果；
[0033]图2是溶藻菌Lzh-2的发酵液乙酸乙酯萃取液加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；
[0034]图3是溶藻物质六氢吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4_ 二酮和二氢吲哚_2，3_ 二酮分别加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；
[0035]图4是溶藻物质六氢吡咯并[1，2-A]吡嗪-1，4_ 二酮和二氢吲哚_2，3_ 二酮分别加入到藻液中对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果。
【具体实施方式】[0036]实施例1溶藻细菌的筛选
[0037]将太湖梅梁湾水域采集的IOmL自然水样加入到90mL对数期的铜绿微囊藻9110的藻液中，两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平板，28°C培养24h，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。
[0038]将筛选出来的菌株分别接种入IOmL牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C，200rpm培养24h，将IOmL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中。另外将IOmL灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基同样加入90mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养48h后计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率最高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为Lzh-2。
[0039]藻液培养条件:铜绿微囊藻9110用BGll液体培养基培养,放置于光照培养箱中，25°C,光照强度40 μ mol photons m-2s_l,光暗周期比为12h:12h (光照:黑暗)。
[0040]溶藻效率计算方法:溶藻效率(%)=(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度X100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度用血球计数板测定。
[0041]图1中A为加入溶藻菌Lzh-2时铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的变化曲线(溶藻菌1^11-2(1\108(^118/1^)(_)和空白对照(令))。B为加入溶藻菌Lzh-2时聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的变化曲线(溶藻菌Lzh-2(1X 108cells/mL) (.)和空白对照(▲))。
[0042]实施例2希瓦氏菌Lzh-2菌株的鉴定
[0043]用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的Lzh-2进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性，直短杆状，极生单鞭毛，大小为0.6 μ m~Ι.Ομ--ΧΙ.Ομπι~4.Ομ--，在液体培养基中摇床培养24h后，个别菌体长达7 μ m。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，无色至淡肉红色，透明，菌落大小为2mm~3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某希瓦氏菌菌株有99%的同源性,故鉴定为希瓦氏菌Shewanella sp.,命名为希瓦氏菌Lzh-2。该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6549，保藏日期为2012年9月14日。保藏机构地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编:100101，电话:86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是HQ896842。
[0044]实施例3希瓦氏菌Lzh-2发酵液及其乙酸乙酯萃取液的制备方法
[0045]将希瓦氏菌Lzh-2按照1%接种量接种于灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C下200rpm摇床培养48h后得到希瓦氏菌Lzh-2含菌发酵液。将乙酸乙酯按照1:1的比例加入发酵液中，放入振荡器中振荡24h，分离出上层溶液，即乙酸乙酯萃取液。将乙酸乙酯蒸干，加水溶解，再使用0.22 μ m孔径的微孔滤膜过滤后用于进一步纯化代谢产物。
[0046]实施例4希瓦氏菌Lzh-2对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果
[0047]将8份培养好的(培养条件:牛肉膏蛋白胨培养基，280C，200rpm培养24h)10mL希瓦氏菌Lzh-2菌液分别加入8株蓝藻和真核藻(表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用IOmL无菌牛肉膏蛋白胨培养基分别加入8种藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)作为对照(1:9)，在光照培养箱中培养4天和6天后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值土标准差的形式。
[0048]实验中用到的藻种有3株购自武汉水生所藻种库，另外5株筛选自太湖水体。实验结果表明，希瓦氏菌Lzh-2的发酵液对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果，对色球藻FACHB-191没表现出很好的溶藻效果(表1)。此结果表明希瓦氏菌Lzh_2的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。
[0049]表1.希瓦氏菌Lzh-2对8株藻株的溶藻效果
[0050]
【权利要求】
1.一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh_2,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC N0.6549，保藏日期为2012年9月14日。
2.如权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2在控制蓝藻水华中的应用。
3.如权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。
4.一种具有结构式(I)所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。
5.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2。
6.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。
7.一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤: . 1)、发酵权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2； .2)、萃取发酵液； .3)、萃取液蒸干得粗提物； . 4)、粗提物水溶后用于控制蓝藻水华。
8.如权利要求7所述的方法，其中步骤I)中，发酵条件为，希瓦氏菌Lzh-2接种于PH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28°C、200rpm环境条件下发酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液。
9.如权利要求7所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯。
10.如权利要求9所述的方法，其中步骤2)中，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。
【文档编号】C12R1/01GK103509744SQ201310413420
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】杨虹, 李正华, 柳向龙, 潘建良, 谭晶 申请人:上海交通大学