黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量pcr检测技术及应用的制作方法

文档序号:518024阅读:349来源:国知局
黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量pcr检测技术及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测黄瓜细菌性角斑病菌的实时荧光定量PCR检测技术及其应用。该检测技术利用荧光染料(SYBRGreenI)和正义引物、反义引物和阳性标准品,建立了实时荧光定量PCR反应体系,可以快速、定量地检测黄瓜细菌性角斑病菌。同时,该方法可直接定量检测模拟病种表面所带的病原菌,省去了提取病原菌DNA的步骤,大大节省检测的时间,降低检测难度,并能真实反应种子带菌量,为病害的早期预测和预警提供方法和基础。因此,该方法适合作为植物病害诊断检测方法推广应用。
【专利说明】黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用

【技术领域】
[0001] 本发明为一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术及应用,专用于检测 黄瓜细菌性角斑病菌,属于农作物病害诊断与防治【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 黄瓜细菌性角斑病由丁香假单胞流泪致病变种sjriflgae pv. /^乃引起,该病原菌属于丁香假单胞50个致病变种之一,是引起黄瓜 (Ci/c腫is safiras)的主要细菌性病害之一。该病原引起细菌性角斑病(Angular leaf spot),在世界上广泛发生,我国主要分布在华北、东北及华中地区,保护地及露地生产中均 有发生。感病植物的主要症状:叶脉呈水浸状小斑点,病斑褪绿,进一步扩展逐渐发展成为 近圆形或不规则病斑,病果会出现水浸状病斑。黄瓜细菌性角斑病发病时间短,在适宜的发 病条件下7-10d可发病,除顶端嫩叶外,可使黄瓜整株叶片枯死,影响结瓜产量,一般减产 可达30%-50%,造成严重的经济损失。
[0003] 传统的病原细菌检测采用培养基分离纯化与致病性鉴定的方法,随后血清学技术 的应用使得病原细菌的快速检测成为可能。Rassmusen和Prosen于1991年首次采用PCR 方法检测植物病原菌及感染种子,推动基于PCR方法的植物病原菌检测技术快速发展。20 世纪90年代中期发展起来的实时荧光定量PCR技术可以对靶标核酸进行精确定量检测,突 破了传统PCR技术只能对目标核酸进行定性检测的局限。实时荧光定量PCR技术的原理是 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准 曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法。常规PCR中,扩增产物(扩增子)是通过终 点法来分析检测,即PCR反应结束后,DNA通过琼脂糖凝胶电泳后进行成像分析。相对常 规PCR而言,应用实时荧光定量PCR方法检测植物病原菌的主要优点是有实时性强,灵敏 度高,特异性强,反应过程封闭,操作简易,处理量高等。
[0004] 对黄瓜细菌性角斑病原菌的快速检测最早采用的方法是免疫学方法,特别是 ELISA。Fogliano等建立基于ELISA的检测方法可以定量到0. lmg/g植物组织的角斑病原 菌。而由于丁香假单胞种下致病变种多,难以获得特异性好的抗体,容易出现假阳性结果。 基于PCR的分子生物学检测方法不受植物病症的限制,具有快速检测的特点。目前,通过 ITS等序列的常规PCR方法可特异性检测角斑病原菌,但由于常规PCR本身存在的局限性, 使得该方法的灵敏度和特异性受到局限,且常规PCR为半定量,不能定量检测受检植株或 种子上的病原菌。由于黄瓜细菌性角斑病原菌为种传,少量甚至微量的病原菌在合适的气 候条件下能够很快地传播,导致严重的病害流行,故高灵敏性和高特异性的实时荧光定量 PCR检测黄瓜细菌性角斑病原菌的方法和对带菌种子的检测技术亟需建立。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于提供角斑病菌的荧光定量PCR快速检测的方法,克服角斑病菌 传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种荧光定量PCR试剂盒在黄瓜细菌性角斑病流 行动态检测和种子带菌的早期检测等应用。
[0007] 该检测技术,在植物病害诊断与防治领域适合推广。
[0008] 本发明的技术具体包括以下步骤: 1、 采用改良CTAB法提取病原菌总DNA,模拟带菌种子采用0. 1%吐温20直接洗脱表面 病原菌,得到相应的DNA样本; 2、 特异性引物设计,为避免PCR反应中出现假阳性结果或对非目标菌株产生非特 异性扩增,本发明通过系统分析丁香假单胞菌属0°. 下不同致病变种的甘 油醛-3-磷酸脱氢酶(#3/77)基因序列,采用CLUSTAL对该区序列进行比较,寻找黄瓜 细菌性角斑病原菌的特异序列,利用Primer5. 0针对该序列设计了其特异性荧光定量 PCR弓丨物Pslgapl-F/Pslgapl-R;通过Blastprogram(http://blast,ncbi.nlm.nih. Rov/Blast.CRi)比较所设计的引物序列与其它生物种属没有显著同源性,并在丁香 假单胞菌属0°. 下不同致病变种间显示出高的特异性。正义引物序列为: (5'-TCGGCGACGCAATCAAT-3'),反义引物序列为:(5'-GGTGGITTCACGCTTCAGG-3'),扩增片段 大为 162bp;Pseudomonassyringaepv.lachrymansStJglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(辟/77)基因部分序列登录号为(HQ171970. 1)和(AY610653. 1); 3、 实时荧光定量PCR反应体系为:荧光定量反应体系为25沿,其中浓度为10Mm〇l/L正 义引物Pslgapl-F和反义引物Pslgapl-R各0.25rt、荧光染料SYBR Premix Ex Taq (内含 TaKaRa Ex Taq TM HS,Mg2+,SYBR Green I 和 dNTP Mixture) 12.51^1,标准品 10 倍梯度稀 释液或待检测样品DNA溶液0. 5W,ddH20补齐至25W ; 4、 PCR反应程序为:PCR采用两步法,94°C 30s,然后94°C 5s、62°C 30s为1个循环, 共35个循环。PCR完成后,按0. 1°C /s升温速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验 证; 5、 pMD-20载体插入辟片段序列后转化大肠杆菌DH5 a进行增殖,提取质粒基因组 DNA,DNA经紫外分光光度计A260定量,10倍梯度稀释成6个浓度梯度(2.6ng-2.6fg DNA / Ul),按照上述PCR反应体系和程序进行扩增;反应结束后,根据各个浓度梯度的循环阈值 (Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线; 6、 取步骤1)中得到的DNA样本作为模板,按上述PCR反应体系和反应程序在实时荧光 定量PCR仪上进行扩增,并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增,其中阴性对照采用ddH 20, 阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA;反应结束后,将DNA样本的循环阈值(Ct)与标准曲 线对照,得到DNA样本中的区基因片段拷贝数,进而得到原来样本中角斑病菌的浓度。
[0009] 黄瓜细菌性角斑病菌荧光定量PCR检测技术可以生成试剂盒,包括标准阳性DNA 模板、荧光定量PCR反应液。
[0010] 标准阳性DNA模板由含有插入目的片段的PGM-T(购自天根公司)载体制备而成。 标准品的制备过程为:采用引物Pslgapl-F和Pslgapl-R扩增角斑病菌的^卻彳部分序列, 电泳PCR产物后切下含有目的片段的凝胶,凝胶试剂盒回收纯化目的片段,加入pGM-T载体 后16°C过夜连接,采用大肠杆菌DH5a感受态细胞转化。转化产物涂布LB平板记性培养, 挑取白斑,采用引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R进行PCR鉴定。通过序列分析进一步鉴定阳 性克隆结果的可靠性。选择PCR和序列分析均为阳性的克隆菌落,将其接种到含有氨苄青 霉素的LB培养基,过夜培养。质粒DNA采用质粒小提试剂盒提取。DNA经A260紫外分光光 度计定量,10倍梯度稀释为2. 6ng-2. 6fg /iil,于-20°C保存。
[0011] 荧光定量反应体系由正义引物Pslgapl-F、反义引物Pslgapl-R、荧光染料SYBR Premix Ex Taq 内含 TaKaRa Ex Taq TM HS,Mg2+,SYBR Green I 和 dNTP Mixture 组成。
[0012] 本发明优化的荧光定量PCR反应体系总体积为25 iil,其中SYBR Premix Ex Taq 12.5111,1011111〇1正义引物?8化&口14和反义引物?8化&口1-1?各0.25111,标准品10倍梯度 稀释液或待检测样品DNA溶液0. 5iU,用ddH20补充至25iU。PCR采用两步法,94°C 30s, 然后94°C 5s、62°C 30s为1个循环,共35个循环。
[0013] 本发明提供的角斑病菌荧光定量PCR试剂盒,针对角斑病菌基因组辟以基因特异 的靶序列设计引物。通过优化反应体系(引物浓度、模版DNA浓度、扩增程序等)的优化,采 用定量检测系统(包括ABI Prism系统、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad),可用于黄瓜细 菌性角斑病菌灵敏的、快速的、准确的定量检测。此荧光定量PCR检测方法多次重复试验误 差值很小,复现性良好,引物对的检测灵敏度限点为2. 6X l(T2fg质粒DNA /yl,相当于297 个细胞,比普通PCR灵敏性高出1000倍。
[0014] 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果: 1)特异性高、鉴定速度快 引物扩增角斑病菌的特异性序列,PCR检测特异性高。自然条件下,传统的分离培养的 方法检测黄瓜细菌性角斑病过程繁琐,鉴定周期长,在生产实践中达不到快速鉴定的要求, 本发明克服了这一不足之处,并且对于病种、病植株表面带菌的检测无需DNA提取步骤,检 测速度快。
[0015] 2)灵敏度高、可准确定量 与普通PCR检测相比,本发明可以准确定量目标菌株。本方法在浓度为2. 6ng-2. 6fg/ ill目标DNA浓度范围内,具有良好的线性关系,且检测灵敏度比普通PCR高1000倍;同时 该检测方法重复性良好。
[0016] 3)实用性高、应用范围广 可以定量检测带菌种子上的黄瓜细菌性角斑病菌,结合该病害种传发病阈值,可以为 病害的早期预测预报提供方法依据。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1是引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R特异性检测PCR扩增结果,其中1、2的模板 为黄瓜细菌性角斑病菌基因组DNA,3~13的模板分别为番茄细菌性斑点病菌DNA、平菇褐斑 病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘蓝黑腐病菌NA、丝瓜叶斑病菌DNA、西葫芦叶斑病菌DNA、大 白菜软腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌DNA、黄瓜枯萎病菌DNA、甘蓝黑斑病菌DNA、黄瓜褐斑病菌 DNA ;N 为阴性对照;M 为 150bp DNA ladder (Takara 公司); 图2实施例1荧光定量PCR扩增的标准曲线,纵轴为Ct值,横轴为Log DNA ;标准误为 0. 997 ; 图3实施例1荧光定量PCR引物特异性扩增溶解曲线,纵轴为Delta Rn;横轴为Cycle Number,曲线a,b,c,d,e和f的模板为阳性标准品,反应体系中DNA含量分别为2. 16ng, 216pg,21.6pg,2. 16pg,216fg,21.6fg ;其中1的模板为黄瓜细菌性角斑病菌基因组DNA, 2?12的模板分别为番茄细菌性斑点病菌DNA、平菇褐斑病菌DNA、番茄青枯病菌DNA、甘蓝 黑腐病菌NA、丝瓜叶斑病菌DNA、西葫芦叶斑病菌DNA、大白菜软腐病菌DNA、甜瓜果斑病菌 DNA、黄瓜枯萎病菌DNA、甘蓝黑斑病菌DNA、黄瓜褐斑病菌DNA ; 图4实施例2中田间病植株样本分离的细菌性角斑病原菌和阳性对照菌株的PCR扩增 结果,其中1~7的模板为分别对应表2中不同黄瓜细菌性角斑病菌供试菌株的基因组DNA ; N 为阴性对照;M 为 150bp DNA ladder (Takara 公司); 图5实施例2田间病植株样本分离的黄瓜细菌性角斑病原菌和阳性对照菌株荧光定量 PCR扩增的溶解曲线,纵轴为Delta Rn;横轴为Cycle Number,模板为分别对应表2中不同 黄瓜细菌性角斑病菌供试菌株的基因组DNA ; 图6普通PCR灵敏性扩增结果,其中1~12的模板为阳性标准品,反应体系中DNA含量 分别为 2. 6ng,260pg,26pg,2. 6pg,260fg,26fg,2. 6fg,0? 26fg,2. 6 X l(T2fg,2. 6 X l(T3fg, 2.6父1041^,2.6\1051^#为阴性对照;]\1为150匕卩0嫩1&(1(161'(丁&1^四公司); 图7实施例3荧光定量PCR阳性标准品的扩增曲线,纵轴为Delta Rn;横轴为Cycle Number,曲线1,2,3,4,5和6的模板为阳性标准品,反应体系中DNA含量分别为2. 16ng, 216pg, 21. 6pg, 2. 16pg, 216fg, 21. 6fg〇

【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实例,进一步阐述发明。应当理解,下列实例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明要求保护范围。 实施例1黄瓜细菌性角斑病菌的特异性引物检测 采用黄瓜细菌性角斑病菌、丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其他蔬菜常见细菌真 菌性病害病原菌为材料,对角斑病菌引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R进行特异性检测。相关 病原细菌菌株在NA培养基培养。其它病原真菌菌株在ro培养基培养;所有菌株由固体培 养基活化后转入液体培养基培养,病原细菌28°C培养24h,病原真菌28°C培养1周后收集菌 丝或菌体提取DNA。DNA的提取采用改良CTAB提取法。
[0019] 以角斑病菌及丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其他蔬菜常见细菌真菌性病 害病原菌基因组DNA为模板,利用引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R进行普通PCR扩增,同时用 该荧光定量PCR体系对上述菌株进行扩增,以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如 下:总反应体积 25 ii L,10XPCR buffer 2. 5 ii L,dNTP (10 ii mol/L)0. 5 ii L,引物(10 ii mol/ L)各 0? 25 ii L,模板 DNAO. 5 ii L,TaqDNA 聚合酶 0? 5 ii L,最后以 ddH20 补足至 25 ii L。PCR 反 应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s,62°C退火30s,72°C延伸30s,共35个循环;72°C 延伸8 min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳检测;突光定量PCR循环结束后,采用 仪器自带的分析软件,分析扩增结果。
[0020] 特异性检测引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R对角斑病菌及丁香假单胞菌属下其他 致病变种以及其它常见真细菌性病原菌的PCR扩增结果,该结果表明该引物具有良好的特 异性。62°C退火条件下,只有角斑病菌扩增出162bp的产物,其他菌株和阴性对照均无相应 扩增产物。荧光定量PCR扩增结果制作标准曲线和扩增曲线,只有阳性质粒克隆和角斑病 菌在89°C有单一峰值,其他对照菌株和阴性对照无明显峰值,说明该引物特异性良好。
[0021] 表1引物特异性检测菌株

【权利要求】
1. 一种黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术,其特征在于包括以下步骤: 1) 采用改良CTAB法提取病原菌总DNA,模拟种子带菌采用0. 1%吐温20直接洗脱表面 病原菌,得到相应的DNA样本; 2) 特异性引物设计,通过分析丁香假单胞菌 sjriflgae)不同致病变种 的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(济识7 )基因序列,采用CLUSTAL方法进行序列比较,对黄瓜细菌 性角斑病原菌设计了其特异性PCR引物对Pslgapl-F/Pslgapl-R,所述的引物对为:正义 引物 Pslgapl-F 序列为:5'_ TCGGCGACGCAATCAAT -3',反义引物 Pslgapl-R 序列为:5'_ GGTGGTTTCACGCTTCAGG -3'; 3) 实时荧光定量PCR反应体系为:荧光定量反应体系为25沿,其中浓度为10Mm〇l/L正 义引物Pslgapl-F和反义引物Pslgapl-R各0.25W、荧光染料SYBR Premix Ex Taq (内含 TaKaRa Ex Taq TM HS,Mg2+,SYBR Green I 和 dNTP Mixture) 12.51^1,标准品 10 倍梯度稀 释液或待检测样品DNA溶液0. 5W,ddH20补齐至25W ; 4. PCR反应程序为:PCR采用两步法,94°C 30s,然后94°C 5s、62°C 30s为1个循环,共 35个循环,PCR完成后,按0. 1°C /s升温速率从72°C升至95°C进行融解曲线的分析验证; 5) 插入辟/72片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5 a增殖后提取的质粒基因组 DNA,DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释,稀释成6个浓度梯度(2. 6ng-2. 6fg DNA y r1),按照上述PCR反应体系和程序进行扩增;反应结束后,根据各个浓度梯度的循 环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线; 6) 取步骤1)中得到的DNA样本作为模板,按上述荧光定量PCR反应体系和反应程序 在实时荧光定量PCR仪上进行扩增,并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增,其中阴性对 照采用ddH20,阳性对照采用角斑病菌菌株基因组DNA ;反应结束后,将DNA样本的循环阈值 (Ct)与标准曲线对照,得到DNA样本中的^^7基因片段拷贝数,进而得到原来样本中角斑 病菌的浓度。
2. 权利要求1所述的一种检测黄瓜细菌性角斑病菌荧光定量PCR检测技术,该技术 可以转化成商品化的检测试剂盒,试剂盒包括:正义引物Pslgapl-F、反义引物Pslgapl-R、 荧光染料 SYBR Premix Ex Taq 内含 TaKaRa Ex Taq TM HS,Mg2+,SYBR Green I 和 dNTP Mixture,以及由插入gapl片段序列的pMD-20载体转化大肠杆菌DH5 a,增殖后提取的质粒 DNA,DNA经紫外分光光度计A260定量并10倍梯度稀释。
3. 权利要求1所述的对黄瓜细菌性角斑病菌的荧光定量PCR检测技术可以应用于对 农田环境中黄瓜植株上细菌性角斑病菌的动态监测,并可以应用于种子带菌及带菌量的检 测。
【文档编号】C12Q1/68GK104450868SQ201310415572
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】李宝聚, 陈璐, 谢学文, 石延霞, 柴阿丽 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1