一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。该高抗TuMV的RNA，是具有下述核苷酸序列之一：1）序列表中的SEQ?ID?№.2所示的核苷酸序列；2）与1）限定的RNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。本发明的RNA和编码该RNA的RNAi载体，可用来增强植物对TuMV或草铵膦除草剂的抗性，同时也为高抗TuMV转基因植物的培育奠定了基础。
【专利说明】—种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体
【技术领域】
[0001]本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体涉及一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
【背景技术】
[0002]完菁花叶病毒(TurnipMosaic Virus, TuMV)属马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyviruse)。TuMV寄主范围十分广泛，能够侵染43科156属318种植物。TuMV是危害十字花科作物最为严重的病毒。感染病毒后的作物还容易感染霜霉病和软腐病，造成复合侵染，直接影响到产量和商品价值。
[0003]油菜是我国主要的油料作物，芜菁花叶病毒病是油菜的重要病害之一。在我国长江中下游，油菜因病毒病减产一般达20-30%，大流行年达50%左右。感病油菜不仅产量降低，而且产油率和种子萌芽率也明显降低。另据调查我国白菜因TuMV危害平均每年造成5-10%的产量损失，病害严重的地块几乎绝收。
[0004]TuMV主要是靠蚜虫以非持久性的方式传播，至少有89种蚜虫可传播该病毒。而采用杀虫剂不可能很快杀死全部的蚜虫以阻止病毒的传播，仅靠杀虫剂杀蚜防治病毒病的效果不明显，还易造成环境污染。因此寻求新的抗病方法成为了一项迫切的任务。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
[0006]本发明提供的一种RNA,具 有下述核苷酸序列之一:
[0007]I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的核苷酸序列；
[0008]2)与I)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0009]所述具有相同功能具体指具有下述任一功能:
[0010]I)增强植物对TuMV的抗性；
[0011]2)增强植物对除草剂的抗性。
[0012]所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
[0013]所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。
[0014]所述TuMV 具体为 TuMV_C4 和 / 或 BJ-ROI。
[0015]所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
[0016]所述RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。
[0017]含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的保护范围。
[0018]所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
[0019]所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-380位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。
[0020]具体的，所述出发载体为pBBBast。
[0021]所述的重组表达载体中，所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQID Na.3所述的第1365-2919位核酸序列。
[0022]本发明的另一个目的是提供所述RNA、所述RNA的编码基因、所述含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用:
[0023]I)制备抗TuMV的产品；
[0024]2)增强植物对TuMV的抗性；
[0025]3)增强植物对草铵膦除草剂的抗性。
[0026]所述应用中，所述植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
[0027]所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。
[0028]所述应用中，所述TuMV具体为TuMV_C4和/或BJ-ROI。
[0029]所述应用中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
[0030]本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述的重组表达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强；2)对除草剂的抗性增强。
[0031 ] 所述对TuMV的抗性增强是通过抑制TuMV复制实现的。
[0032]所述方法中，所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-ROl。
[0033]所述方法中，所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
[0034]所述方法中，所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为中间载体的酶切验证结果，其中M为分子量标记；泳道I为pHannibal-CI载体的酶切结果；泳道2为连入反向片段pHannibal-CI (-)载体的酶切结果；泳道3为pHannibal空载体的酶切结果。
[0036]图2为载体pBBBTu-CI的结构示意图。
[0037]图3为植物表达载体pBBBTu-CI的MluI酶切检测结果图，其中M为分子量标记；泳道I为pBBBTu-CI载体的酶切结果。
[0038]图4为T1代苗喷洒草铵膦除草剂后结果，存活的为除草剂抗性株。
[0039]图5为部分转基因T1代苗PCR鉴定结果图，其中泳道2为分子量标记；泳道I为对照col-0的结果；泳道3-9为除草剂筛选出的转基因T1代苗的结果。
[0040]图6为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0041]图7为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后种子收获时的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0042]图8为转基因高抗株系#07和#48接种 BJ-ROl后的图片，其中col代表野生型col-0的结果。
[0043]图9为不同转基因高抗株系接种TUMV-C4后的病情指数统计结果，其中col代表野生型col-0的结果，#07，#12, #19, #22, #30, #34, #48分别代表7个转基因高抗株系的结果。
[0044]图10为TuMV-C4接种拟南芥后，RT-PCR检测TuMV外壳蛋白基因在转基因拟南芥中的表达，其中泳道I为对照Col-O的结果；泳道2-6依次为转基因高抗株系#07，#12，#22，#34, #48的结果。
[0045]图11为TUMV-C4接种拟南芥后，荧光定量PCR分析结果，其中col代表野生型col-0的结果，#07，#12, #22, #34, #48分别代表5个转基因高抗株系的结果。
【具体实施方式】
[0046]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048]1、材料
[0049]本实验所用野生型拟南芥Col-O 购自 Arabidopsis Biological ResourceCenter0
[0050]北京地区芜菁花叶病毒TuMV主要的流行强致病株系TuMV-C4获自中国农业科学院蔬菜花卉所；参考文献:冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生，北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定，中国蔬菜，1988,4:11-13 ;公众可从北京农业生物技术研究中心获得该株系O
[0051]TuMV萝卜强致病株系BJ-ROI为发明人从田间釆集并保存。参考文献“叶艳英、曾钢、闫晓红、马荣才、吴才君、姚磊，江西农业大学学报，2012,34(2):264 — 269”。公众可从北京农业生物技术研究中心获得。
[0052]大肠杆菌(Escherichia coli) DH5 α菌株购自Tiangen公司，产品目录号为CBlOl ；
[0053]农杆菌(Agrobacteriumtumefacieus) GV3101 (pMP90)，参考文献:Koncz，C.and Schell，J.(1986)The promoter of TL-DNA gene5controls the tissue-specificexpression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binaryvector.Mol.Gen.Genet.204，383 - 396。公众可从北京农业生物技术研究中心获得该菌株。
[0054]RNAi 载体 pHannibal 公众可从 CSIRO (http://www.csir0.au/pi)获得；参考文献:Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A.Construct design forefficient, effective and high-throughput gene silencing in plants[J].The PlantJournal, 2001，27(6): 581-590。
[0055]高保真酶Fast pfu DNA Polymerase、Easy Taq酶和分子量标记购自全式金公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。M-MLV反转录酶、定量PCR试剂、限制性内切酶和Klenow Fragment补平酶购自TaKaRa公司。dNTP、dGTP 和 dCTP 购自 Promega 公司。
[0056]实施例1、RNAi载体的制备
[0057](一)Cl基因保守片段的制备[0058]根据GenBank已登录的118个TuMV株系的保守性，选取Cl基因的第882-1247位核苷酸序列共366bp的保守片段为RNA干扰靶标。
[0059]提取TuMV-C4菌株的总RNA，并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，以下述CI366F和CI366R (下划线部分为酶切位点Xho 1.BamH I和EcoR 1.Hind III)为引物，用高保真酶 Fastpfu DNA Polymerase 进行 PCR 扩增:
[0060]CI366 F 5’ -ccctcgagggatccTGGAACACCTAGCAAGAAGCACT_3’ ；
[0061]CI366 R 5’ -cggaattcaagcttCGTGCCTGCTTTGCCGTTAC_3’ 。
[0062]PCR 扩增程序:94 °C 5min ；94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，30 个循环；72 °C 延伸7min。
[0063]PCR产物经琼脂糖电泳纯化后回收。所得PCR产物经测序证明核酸序列正确，其核酸序列具有序列表中SEQ ID Ns.1所示的核酸序列，其编码的RNA的具有序列表中SEQ IDNa.2所示的核酸序列。
[0064](二)RNAi载体的构建
[0065]1、中间载体pHannibal-CI的制备
[0066]I)制备过程
[0067]用Hind III和BamH I分别双酶切pHannibal载体和上述制备的PCR产物。酶切后经纯化回收约5818bp的载体骨架片段和约372bp的PCR产物片段，4°C连接过夜。连接产物经热击转化大肠杆菌DH5 α。挑取克隆，提取质粒并用PstI和XhoI酶切验证，获得含反向片段的中间载体pHannibal-CI (-)。
[0068]用XhoI和EcoRI分别双酶切上述制备的PCR产物和连入反向片段的pHannibal-CI (-)中间载体。酶切产物经纯化后回收约6184bp载体骨架片段和约384bp的PCR产物片段，4°C连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5 α，挑取克隆，提取质粒并用PstI和XhoI双酶切验证，获得同时含反向和正向片段的中间载体pHannibal-CI。
[0069]2)所构建载体的酶切验证过程
[0070]用XhoI和PstI分别双酶切pHannibal空载体、连入反向片段的pHannibal-CI (-)和pHannibal-CI中间载体,酶切后电泳检测,进行验证实验。实验结果见图1。图1结果显示:pHannibal空载体经双酶切后产生4276bp和1548bp两条片段，pHannibal-CI㈠经双酶切后产生4276bp和1914bp两条片段，pHannibal-CI经双酶切后产生4276bp和2292bp两条片段。酶切及电泳结果表明，中间载体pHannibal-CI构建正确。
[0071]2、植物表达载体pBBBTu-CI的制备
[0072]I)制备过程
[0073]pHannibal的RNAi发卡结构两端各含有I个NotI酶切位点。用NotI酶切含发卡结构的中间载体pHannibal-CI，同一酶切体系中再用Klenow酶和dGTP在酶切片段的两个粘性末端各补两个碱基G，产物于1% 琼脂糖凝胶电泳纯化，胶回收含发卡结构的3708bp的片段备用。经测序，所述含发卡结构的3708bp的片段具有序列表中SEQ ID N2.3所述的核苷酸序列，所述发卡结构片段具有序列表中SEQ ID Na.3所述的第1365-2919位核酸序列。
[0074]植物表达双元载体pBBBast可为将具有序列表中SEQ ID Na.4所示核酸序列的双链DNA分子插入载体pBBRlMCS-2的SspI酶切位点，取代质粒pBBRlMCS_2的SspI酶切位点之间的小片段得到的重组质粒。
[0075]质粒pBBRlMCS-2公众可以从北京农业生物技术研究中心获得；参考文献=KovachME, Elzer PHj Hill DS，Robertson GTj Farris MAj Roop RM2nd, Peterson KM.Four newderivatives of the broad—host—range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Gene.1995Decl;166(I):175-6。
[0076]用XmaI单酶切植物表达双元载体pBBBast，再用Klenow酶和dCTP在两个粘性末端各补两个碱基C，产物于1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收载体片段6559bp，再与上述制备的含发卡结构的3708bp片段4°C连接过夜，即得植物表达RNAi质粒pBBBTu-CI，其结构示意图见图2。
[0077]2)所构建载体的酶切验证过程
[0078]将上述制备的植物表达载体pBBBTu-CI进行MluI酶切检测。pBBBast载体本身有一个MluI酶切位点，连接上述含发卡结构的片段的CaMV启动子上另有一个MluI酶切位点，酶切后显示2条带的为阳性克隆。根据酶切条带大小可判断插入是顺时针正向连接或逆时针反向连接。正向连接酶切条带为9715bp和542bp，反向连接条带为6494bp和3773bp条带。MluI酶切检测结果见图3。图3结果表明针对Cl基因保守片段的RNAi结构已经连入植物表达双元载体pBBBast的XmaI酶切位点中，并且为反向连接。
[0079]实施例2、高抗TuMV的RNA及编码该RNA的RNAi载体的功能验证
[0080](一)拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选
[0081]利用电击法将pBBBTu-CI载体转入农杆菌GV3101 (pMP90)中，采用农杆菌介导的花序浸溃法侵染拟南芥。将收获的拟南芥Ttl代种子播种于盛有营养土的培养托盘中，置于220C (昼)/18°C (夜)，光照周期为16h (光)/8h (暗)的人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L)筛选阳性苗。
[0082]经喷洒2-3次草铵膦除草剂筛选后，非转基因苗不能继续生长，逐渐枯黄死亡；而转基因苗长势茁壮，叶片保持绿色，部分幼苗的结果见图4。共获得126株T1代除草剂抗性植株。随机抽取68株抗性苗的叶片，用小量快速法提取植物基因组DNA。用引物CI366F和CI366R 进行 PCR 扩增检测，反应条件为:94°C 5min ；94°C 45s, 55°C 30s, 72°C 30s, 35 个循环；72°C 7min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，扩增出目的基因片段394bp的为转基因阳性苗。检测结果显示全部为阳性苗。部分幼苗的PCR鉴定结果见图5。
[0083]选取鉴定为阳性苗的转基因Tl代苗自交留种，T2代随机抽取32个株系播种，幼苗喷洒2-3次用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂，其中草铵膦浓度为200mg/L)后统计存活/死亡比。有18个株系分离比约为3:1，初步确认为单拷贝株系，并单株自交收种子。后代继续筛选不分离株系即为纯合株系。
[0084](二)转基因植株的抗病鉴定
[0085]随机抽取12个纯合株系进行抗病鉴定。将纯合株系、野生型Col-O和转空载体拟南芥同时进行播种，待幼苗长至8-10片莲座叶时期摩擦接种TuMV的TuMV-C4或BJ-ROl毒株。接种液按病叶重/磷酸缓冲液体积(pH=7.0)约lg/10mL比例配制。每个纯合株系接种8-12株，每株接种两片较大叶片。以非转基因野生型拟南芥Col-O和转空载体拟南芥作为对照接种。接种几分钟后立即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩隔离观察，20天后进行抗病鉴定及病情指数统计。
[0086]病情等级划分:0级完全无症状；1级1-2片未接种叶花叶或发黄，能抽薹；3级3-4片未接种叶花叶或发黄能抽薹；5级5-6片未接种叶花叶或发黄，影响抽薹；7级多数叶片花叶或发黄，不能抽薹；9级大部分叶片枯死，植株濒临死亡。
[0087]病情指数=100 X Σ (各级病株数X各级代表值)/ (调查总株数X最高级代表值)
[0088]抗病接种的部分结果见图6、7、8，病情指数统计结果见图9。图6结果显示，接种TuMV-C4后20天左右，对照野生型Col-O已基本枯萎死亡，转空载体对照结果与Col-O基本一致，而转基因株系表现出不同的抗性，7个株系(#07，#12，#19，#22，#30, #34, #48)接种后能较好的生长，且后期能够正常结实，表现出对TUMV-C4的高度抗性。图7结果显示，到种子收获时期接种TuMV-C4的高抗转基因株系可以正常结籽；而对照Col-O的植株已经全部死亡，无种子可收获。图9结果显示，接种TUMV-C4后，病情指数统计结果显示高抗株系的抗病性比对照植株Col-O抗性提高约80%，转空载体对照结果与Col-O基本一致。
[0089]高抗转基因株系#07和#48接种BJ-ROl后，图8结果显示，对照野生型Col-O发病显症，而高抗转基因株系#07和#48表现出较好的长势，其对BJ-ROl同样具有高度的抗性。说明本发明对TuMV不同株系的抗性具有一定的广谱性。
[0090]高抗转基因株系留种，后代继续进行抗病鉴定。结果显示这些转基因株系对TuMV的高抗性可以稳定遗传。
[0091](三)半定量和相对定量检测病毒的累积
[0092]5个高抗株系#07，#12，#22，#34, #48、对照Col-O及转空载体对照接种TuMV_C4后约20天，选取各株系未接种叶片用TRIzoI法分别提取总RNA，用M-MLV反转成cDNA。以TuMV外壳蛋白基因的196bp保 守片段为检测对象，以拟南芥SAND基因(AT2G28390)的298bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。
[0093]扩增TuMV-CP基因的196bp保守区段的引物序列如下所示:
[0094]CP F 5，-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3，；
[0095]CPR 5，-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’。
[0096]扩增内参基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示:
[0097]SAND F 5’-AATGTGGATGGTGACACTGCCTCG-3 ；
[0098]SAND R 5’-ACCTGGTGATTTCCTGCCTTGAC-3’ 。
[0099]RT-PCR 反应程序:94°C 5min ；94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C 7min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
[0100]荧光定量PCR的反应以稀释40倍的cDNA为模板，SYBR-green I做荧光指示剂，反应程序采用两步法扩增。扩增条件为:95°C 30s ；95°C 5s, 57°C 30s, 72°C 30s，40个循环。每个株系样品进行3次重复实验，取平均值。
[0101]半定量检测结果见图10。图10结果显示，在内参基因表达量差不多一致的情况下，对照Col-ο植株体内能检测到大量的病毒累积，转空载体对照结果与Col-O基本一致，而在高抗转基因株系体内只能检测到微量的病毒。
[0102]荧光定量PCR的检测结果见图11。图11结果显示，与半定量的结果一致，在对照Col-O体内检测到大量的病毒，转空载体对照结果与Col-O基本一致，而5个高抗株系植物体内几乎检测不到病毒的复制。说明利用Cl基因片段构建的RNAi载体在转基因植物抗病毒中发挥了重要作用， 转基因植株的抗病性显著提高。
【权利要求】
1.一种RNA,具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的核苷酸序列； 2)与I)限定的RNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的RNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
2.权利要求1所述的RNA的编码基因。
3.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的；所述DNA片段为X正向一连接区一X反向；X正向为SEQ ID N0.1中第15-380位核苷酸所示，X反向为X正向的反向互补片段。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述X正向一连接区一X反向片段具有序列表中SEQ ID Na.3所述的第1365-2919位核酸序列。
6.权利要求1所述的RNA、权利要求2所述的编码基因、权利要求3-5任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用: O制备抗TuMV的产品； 2)增强植物对TuMV的抗性； 3)增强植物对草铵膦除草剂的.抗性。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求4或5所述的重组表达载体转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强；2)对草铵膦除草剂的抗性增强。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物；所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
【文档编号】C12N1/19GK103468719SQ201310424848
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】姚磊, 叶艳英, 曾钢, 曹鸣庆, 马荣才 申请人:北京农业生物技术研究中心