一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法

文档序号:519655阅读:311来源:国知局
一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法
【专利摘要】一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法,属于生物化工【技术领域】。本发明包括如下步骤:(1)结合猪源性成分特异核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备,(2)样品中核酸片段的提取和处理,(3)猪源性成分掺假的快速鉴别。本发明利用金纳米粒子聚集会发生变色的特殊光学性质,结合特异性的猪源性核酸序列,建立了特异性猪源DNA序列的探针检测体系,根据比色结果实现了猪源性成分的快速鉴别,当样品中含有5%及以上的猪源性成分即可被检测出来,填补了现有的猪源性成分的快速鉴别技术空白,使得现场快速鉴别肉类掺假成为可能。
【专利说明】一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法
【技术领域】
[0001]一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法,属于生物化工【技术领域】。
【背景技术】
[0002]在利益的驱动下,使用猪肉冒充牛肉的掺假事件可谓层出不穷,针对肉类的造假和掺假,目前鉴别肉类掺假的检测方法一般基于PCR技术,而常规的PCR检测需要扩增、电泳及酶切确证三步技术,从检样到报告结果,至少需要5个小时,缺少现场快速筛选的检测手段,使得错检、漏检等现象时有发生,极大地损害了国家利益和消费者利益。因此,发明一种新型肉类成分快速鉴别方法,是当前的迫切需要。
[0003]本发明利用金纳米粒子的特殊光学性质和特异性的猪源性核酸序列,结合采用比色方法实现了猪源性成分的快速鉴别,当样品中含有5%及以上的猪源性成分即可被检测出来。

【发明内容】

[0004]本发明的目的:提供一种快速的猪源性成分掺假的鉴别方法,使得现场快速鉴别成为可能。
[0005]本发明的技术方案:一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法,步骤为:
猪源性成分特异性核酸序列的选择:
根据Genebank公布的猪线粒体基因的保守序列(GenBank:AF039170.1),选择了5’-CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC-3’这一能代表猪种属的特异性序列片段。其中片段长度为29bp,约10nm,该核酸序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0006](I)结合猪源性成分特异核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备:
采用表面带负电的金纳米粒子,粒径为5~30nm,浓度为30nmol/L,其中金纳米粒子的合成方法为柠檬酸三钠还原法,合成及处理步骤如下:量取IOOmL 0.1g/L的HAuCl4溶液加至三角烧瓶,搅拌加热至沸腾,5 min后快速加入]^5mL 10g/L的柠檬酸三钠溶液,继续加热30min,冷却后,装入分子量12000道尔顿的透析袋,用超纯水透析2天,期间换水3次。取100 μ L金纳米粒子溶液至1.5mL EP管,用超纯水稀释至lmL,得到3nmol/L浓度的金纳米粒子溶液,加入A260=0.27即浓度为10 μ g/mL的猪肉特异性DNA序列探针10~50 μ L,振荡混匀,将EP管置于水浴中温育,时间为5~30min,水浴温度为25飞(TC,此时核酸片段吸附在金纳米粒子表面,得到了具有一定耐盐能力的金纳米粒子探针体系。
[0007]DNA:5’ -CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC-3’,
(2)样品中核酸片段的提取和处理:
取含有疑似猪肉成分的肉类,剪碎后,准确称取0.1g置于1.5mL EP管中,加入ImL组织裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5),100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.4 mg/mLproteinase K),盖上盖子,将EP管置于沸水中煮,时间为l(T30min,将EP管于5000rpm离心IOmin,吸取上清。上清中加入等体积抽提液(酹:氯仿:异戍醇体积比=25:24:1),混匀,静置5min,5000rpm离心lOmin,吸取上层水相上清液,上清液中加入等体积冰无水乙醇,轻轻摇匀,静置15min,用吸头小心吸取析出的DNA’形成的白色絮状物,用70%乙醇漂洗2次,加入100 μ L超纯水溶解,将提取的DNA’样品进行紫外检测,确认A26tlA28tl的数值在
1.8~1.9左右,并用超纯水调节DNA’浓度,使其A26Q=2.7,此时DNA’浓度约为100 μ g/mL。
[0008](3)猪源性成分掺假的快速鉴别:
吸取提取处理得到的DNA’样品10-50μ L,加至ImL的金纳米粒子探针体系,37°C温育5~30min,探针体系中加入10% NaCl溶液100 μ L,混匀,静置5min,观察金纳米粒子探针体系的颜色变化,如果DNA’样品中含有猪肉DNA,则该DNA会与原先吸附在金纳米粒子表面的特异性核酸序列DNA进行特异性结合,形成双链DNA,因此原先的金纳米粒子失去了耐盐能力,在NaCl的存在下,探针体系颜色变成灰色或有蓝灰色沉淀产生,说明检测的DNA’样品中含有猪肉DNA,且猪肉占的比例至少为5% ;如果探针体系的颜色仍是红色,则说明检测的DNA’样品中不含猪肉DNA。
[0009]本发明的有益效果:本发明利用特异性的猪源性核酸序列的互补片段,结合金纳米粒子的特殊光学性质,采用比色方法实现了猪源性成分的快速鉴别,使得现场快速鉴别肉类掺假成为可能。
【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1、猪源性DNA成分鉴别原理图 图2、实际掺假样品鉴别图
1-6为从左至右分别测定了含有0%,1%,2%,5%,10%, 20%猪肉的肉类样品,从图可见,当样品中含有5%猪肉时,金纳米粒子出现明显的变色,肉眼可以很容易判断。
【具体实施方式】
[0011 ] 下述实例中所使用的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
[0012]下述实例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0013]实施例1结合猪源性成分特异核酸序列DNA的金纳米粒子探针体系的建立 采用表面带负电的IOnm金纳米粒子,浓度为30nmol/L,具体合成及处理步骤如下:量
取IOOmL 0.lg/L的HAuCl4溶液加至三角烧瓶,搅拌加热至沸腾,5 min后快速加入3mL10g/L的柠檬酸三钠溶液,继续加热30min,冷却后,装入分子量12000道尔顿的透析袋,用超纯水透析2天,期间换水3次。取100 μ L金纳米粒子溶液至1.5mL EP管,用纯水稀释至ImL,得到3nmol/L浓度的金纳米粒子溶液,加入A26tl=0.27即浓度为10 μ g/mL的DNA探针30 μ L,振荡混匀,将EP管置于40°C水浴中温育lOmin,得到金纳米粒子探针体系。
[0014]实施例2样品中核酸片段的提取和处理
取含有疑似猪肉成分的肉类,剪碎后,准确称取0.1g置于1.5mL EP管中,加入ImL组织裂解液(10 mM Tris-HCl (pH 7.5),100 mM NaCl, 10 mM EDTA,0.5% SDS,0.4 mg/mLproteinase K),盖上盖子,将EP管置于沸水中煮20min,将EP管于5000rpm离心lOmin,吸取上清。上清中加入等体积抽提液(酚:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1),混匀,静置5min,5000rpm离心lOmin,吸取上层水相上清液,上清液中加入等体积冰无水乙醇,轻轻摇匀,静置15min,用吸头小心吸取析出的DNA’形成的白色絮状物,用70%乙醇漂洗2次,加入100 μ L超纯水溶解,将提取的DNA’样品进行紫外检测,确认A26tZA28tl的数值在1.8^1.9左右,并用超纯水调节DNA’浓度,使其Α26ι=2.7,此时DNA’浓度约100 μ g/mL。
[0015]实施例3比色法检测过程实施
吸取提取处理得到的DNA’样品30 μ L,加至ImL的金纳米粒子探针体系,37°C温育5-30min,探针体系中加入10% NaCl溶液100 μ L,混匀,静置5min,观察金纳米粒子探针体系的颜色变化,如果颜色仍是红色,说明检测的DNA’样品中不含猪肉DNA,如果探针体系颜色变成灰色或有蓝灰色沉淀产生,则说明检测的DNA’样品中含有猪肉DNA,且猪肉占的比例至少为5%。
【权利要求】
1.一种猪源性成分掺假的快速鉴别方法,其特征在于步骤为: (O结合猪源性成分特异核酸序列DNA的金纳米粒子探针的制备: 采用粒径为5~30nm,浓度为30nmol/L,表面带负电的金纳米粒子,用超纯水透析,除去合成过程中过量的柠檬酸三钠分子;取10(^1^金纳米粒子溶液至1.5!^ EP管,用超纯水稀释至lmL,得到3nmol/L浓度的金纳米粒子溶液,加入A260=0.27即浓度为10 μ g/mL的猪肉特异性DNA序列探针10-50 μ L,振荡混匀,将EP管置于水浴中温育,时间为5~30min,水浴温度为25飞(TC,此时核酸片段吸附在金纳米粒子表面,得到了具有一定耐盐能力的金纳米粒子探针体系;
DNA:5’ -CAA CTA GAT ACA TCT ACA TGA TTC ATT AC-3’, (2)样品中核酸片段的提取和处理: 取含有疑似猪肉成分的肉类,剪碎后,准确称取0.1g置于1.5mL EP管中,加入ImL组织裂解液,组织裂解液组成为pH 7.5 的 10 mM Tris-HClUOO mM NaClUO mM EDTA、0.5% SDS和0.4 mg/mL proteinase K,盖上盖子,将EP管置于沸水中煮,时间为10~30min,将EP管于5000rpm离心IOmin,吸取上清,上清中加入等体积抽提液,抽提液组成为:酹:氯仿:异戊醇体积比=25:24:1,混匀,静置5min,5000rpm离心lOmin,吸取上层水相上清液,上清液中加入等体积冰无水乙醇,轻轻摇匀,静置15min,用吸头小心吸取析出的DNA’形成的白色絮状物,用70%乙醇漂洗2次,加入100 μ L超纯水溶解,将提取的DNA’样品进行紫外检测,确认A26tZA28tl的数值在1 .8^1.9,并用超纯水调节DNA’浓度,使其Α26(ι=2.7,此时DNA’浓度为 100 μ g/mL ; (3)猪源性成分掺假的快速鉴别: 吸取提取处理得到的DNA’样品10-50μ L,加至ImL的金纳米粒子探针体系,37°C温育5~30min,探针体系中加入10% NaCl溶液100 μ L,混匀,静置5min,观察金纳米粒子探针体系的颜色变化,如果颜色仍是红色,说明检测的DNA’样品中不含猪肉DNA,如果探针体系颜色变成灰色或有蓝灰色沉淀产生,则说明检测的DNA’样品中含有猪肉DNA,且猪肉占的比例至少为5%。
【文档编号】C12Q1/68GK103484549SQ201310445787
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】冯永巍, 王琴, 田耀旗 申请人:无锡市产品质量监督检验中心
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