一种肿瘤细胞系的构建方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种可以高效刺激DC细胞致敏的抗原来源，即从肿瘤组织中分离得到肿瘤细胞，然后通过基因（bcl-2和erbB-1）的转染，使其形成个体化的肿瘤细胞系，从而达到可以连续多次、高效刺激致敏DC细胞，使其将抗原递呈T淋巴细胞后，产生高效特异性杀伤功能的CTL细胞的方法。
【专利说明】一种肿瘤细胞系的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种肿瘤细胞的分离、培养和建系，并用此细胞系对树突状细胞(Dendritic cell, DC)进行高效致敏的方法。 【背景技术】
[0002]人体的免疫系统可以分为天然免疫和获得性免疫系统两部分。DC细胞作为最主要的连接天然免疫和获得性免疫系统的桥梁，可以捕获侵入机体的微生物、被病毒感染的细胞以及发生变异的肿瘤细胞的抗原信息，并递呈给获得性免疫系统，激活B细胞和T细胞，使其产生特异性的免疫反应。
[0003]DC细胞最初由Ralph Steinman于1973年发现，随后，DC细胞极强的抗原递呈能力逐渐得到广大研究人员的确认。DC细胞作为过继性细胞免疫治疗的一种手段，也逐渐在临床上展开应用。截止的目前，有超过400家的医疗机构正在进行DC细胞相关的临床研究。
[0004]利用DC的抗原递呈能力，研究人员可以在体外培养DC细胞，然后通过加入的各种形式的抗原来刺激DC，使其致敏，致敏后的DC再与T淋巴细胞共培养，即可将抗原递呈给T细胞，促进T细胞分化成为具有特异性杀伤功能的细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)。
[0005]现在主要的用于刺激DC致敏的抗原来源包括合成短肽、肿瘤细胞株以及患者手术所得的肿瘤组织裂解液等。其中肿瘤细胞株和合成短肽，由于所含抗原信息很难与患者个体的肿瘤抗原信息一致，所以其免疫原性较低，最终得到的CTL的杀伤活性较低；而肿瘤组织中由于超过95%的成分是内皮细胞、基质细胞和侵润性淋巴细胞等，所以其致敏DC效果较差，且肿瘤组织数量有限，只能进行有限几次的致敏操作。
[0006]综上，寻找一种可以高效刺激DC细胞致敏的大量的肿瘤抗原来源就成了目前全世界科研工作者努力的目标。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种可以高效刺激DC细胞致敏的抗原来源，即从肿瘤组织中分离得到肿瘤细胞，然后通过基因(bcl-2和erbB-Ι)的转染，使其形成个体化的肿瘤细胞系，从而达到可以连续多次、高效刺激致敏DC细胞，使其将抗原递呈T淋巴细胞后，产生高效特异性杀伤功能的CTL细胞的方法。
[0008]本发明肿瘤细胞系的构建方法，包括如下的步骤:
[0009]I)从肿瘤组织分离浓缩肿瘤细胞:用RPMI 1640培养基冲洗肿瘤组织；再用将肿瘤组织剪碎研磨后离心收集肿瘤细胞；用RPMI 1640培养基重悬肿瘤细胞制成细胞悬液；将细胞悬液加在肿瘤细胞分离液上，离心后从液体界面中间收集白色细胞层，将收集的细胞用RPMI 1640培养基稀释后接种到细胞培养板中；
[0010]2)基因转染:细胞贴壁后，将含有特定基因的慢病毒加入到细胞培养板中进行转染，病毒滴度大于IO7单位/毫升；
[0011]其中特定基因为bcl-2基因和erbB-Ι基因，bcl-2基因核苷酸序列为SEQ IDNO:1 ；erbB-l基因核苷酸序列为SEQ ID NO: 3。
[0012]3)将基因转染后的肿瘤细胞培养基进行培养，培养3-5天后，将培养的肿瘤细胞用胰蛋白酶酶解，进行细胞传代建立肿瘤细胞系。
[0013]步骤3)所述的肿瘤细胞培养基，其配方组成如下:硝酸钙100mg/L，氯化钾400.00mg/L,硫酸镁 48.80mg/L,氯化钠 6000.00mg/L,碳酸氢钠 2000mg/L，磷酸二氢钠677.00mg/L、L-精氨酸 200.00mg/L, L-天冬酰胺 56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L, L-组氨酸 15.00mg/L, L-羟脯氨酸 20.00mg/L, L-异亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.00mg/L, L-赖氨酸盐酸盐 40.0mg/L,L-蛋氨酸 15.00mg/L, L-苯丙氨酸 15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-丝氨酸 30.0Omg/L, L-苏氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸 20.00mg/L, L-缴氨酸 20.00mg/L,对氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化胆碱3.00mg/L,维生素B120.005mg/L,叶酸1.00mg/L,肌醇35.00mg/L,烟酰胺1.00mg/L,泛酸钙0.25mg/L,盐酸批卩多醇1.00mg/L,核黄素 0.20mg/L,盐酸硫胺素 1.00mg/L,葡萄糖 2000.00mg/L,谷胱甘肽 1.0mg/L,酹红 5.0mg/L。
[0014]为了加速肿瘤细胞的贴壁和生长，在上述的肿瘤细胞培养基另外添加了表皮生长因子0.0lmg/L,胰岛素8mg/L,转铁蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。
[0015]待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集IO7肿瘤细胞，用5毫升培养基重悬，然后反复冻融，使细胞彻底裂解，将裂解液加入提前培养到第6天的患者DC细胞中，48小时后，收集刺激致敏的DC细胞加入到患者CIK细胞中，24小时后，收集CIK细胞作为效应细胞，用患者肿瘤细胞作为祀细胞，测定杀伤活性。结果经个体化肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤，在效靶比为5:1的条件下，可以达到28.6%，远高于未致敏组(13.7%)。
[0016]本发明的方法所构建的肿瘤细胞系可以多次传代，最大限度的保留了患者个体化的肿瘤抗原信息。本发明的主要特点是:分离、浓缩得到较高纯度的肿瘤细胞，然后通过转入bcl-2和erbB-Ι基因，高效的构建个体化的肿瘤细胞系。由于肿瘤组织本身结构以及组分的复杂性，导致从肿瘤组织构建肿瘤细胞系的成功率较低，通常不超过10%，而一些种类的肿瘤得到细胞系的可能性甚至低于3%，而使用本发明的方法，构建肿瘤细胞系的成功率可以达到70%以上，并可以用于持续的刺激DC细胞致敏。到目前为止，仍未见有通过慢病毒系统转染bcl-2和erbB-Ι基因构建肿瘤细胞系的研究报道，本发明首次提供一种高效构建个体化肿瘤细胞系，并用于刺激DC细胞致敏的方法。
【具体实施方式】
[0017]下面结合具体实施例对本发明的个体化肿瘤细胞系构建方法进行描述。
[0018]实施例1
[0019]1、从肝细胞癌手术样品分离浓缩肿瘤细胞:用手术剪去除脂肪组织和血管；用RPMI 1640培养基冲洗剩余肿瘤组织；用手术剪将肿瘤组织剪成小块，然后用粗头吸管研磨并反复吹打，过100目筛网，去除剩余的较大的团块。将细胞悬液300g离心5分钟，弃上清；细胞沉淀用5毫升的RPMI 1640培养基重悬；将细胞悬液轻轻加在5毫升密度为1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分离液上，800g离心15分钟；从液体界面中间收集白色细胞层，将细胞用肿瘤细胞专用培养基稀释到2xl06个细胞/毫升，接种到24孔细胞培养板，每孔1.5毫升。[0020]为了获得更好的培养效果，对培养基的组分及配比进行了长期的优化，最终获得如下的配方:硝酸钙100mg/L，氯化钾400.00mg/L，硫酸镁48.80mg/L，氯化钠6000.00mg/L,碳酸氢钠2000mg/L,磷酸二氢钠677.00mg/L>L-精氨酸200.00mg/L, L-天冬酰胺56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L,L-组氨酸 15.00mg/L, L-轻脯氨酸 20.00mg/L, L-异亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.0Omg/L, L-赖氨酸盐酸盐40.0mg/L, L-蛋氨酸15.00mg/L, L-苯丙氨酸15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-丝氨酸 30.00mg/L, L-苏氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸20.00mg/L, L-缴氨酸20.00mg/L,对氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化胆碱 3.00mg/L,维生素 B120.005mg/L,叶酸 1.00mg/L,肌醇 35.00mg/L,烟酰胺 1.00mg/L,泛酸钙0.25mg/L,盐酸吡卩多醇1.00mg/L,核黄素0.20mg/L,盐酸硫胺素1.00mg/L,葡萄糖2000.00mg/L，谷胱甘肽 1.0mg/L，酚红 5.0mg/L。[0021]为了加速肿瘤细胞的贴壁和生长，在上述的肿瘤细胞培养基另外添加了表皮生长因子0.0lmg/L,胰岛素8mg/L,转铁蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。[0022]上述培养基是 申请人:长期优化获得的，在同样的培养条件下，与常规的PRMI1640培养基相比，可以将原代肿瘤细胞的贴壁时间提前I~2天，贴壁细胞的比例提高25%左右。[0023]2、基因转染:将bcl-2 (基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，氨基酸序列为SEQ IDN0:2)和erbB-l基因(基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，氨基酸序列为SEQ ID NO:4)片段分别插入到慢病毒载体pEFlalpha-1RES Vector (购自clontech)的两个多克隆位点，构建目的基因载体；提前24小时将5\106个1^社丨42931'包装细胞接种到10厘米的培养皿中；将适量的目的基因载体与36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5微升Xfect Polymer,1150微升Xfect Reaction Buffer混合后，室温静置10分钟，然后加入到培养皿中；将培养皿至于37°C 二氧化碳培养箱中过夜；更换新的培养基；48小时后，收集上清液，过0.45微米的无菌滤膜，过滤液即为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5.2 X IO7单位/毫升。[0024]肿瘤细胞培养4天后，观察细胞贴壁良好，状态稳定。将步骤2中的病毒悬液加入到肿瘤细胞的24孔培养板中，500微升/孔。[0025]扩大培养:在转染3天后，观察到细胞开始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，进行细胞传代；每3天进行一次传代操作。[0026]抗性筛选:进行5次传代培养后，开始抗性筛选。因为pEFlalpha-1RES Vector中带有neo抗性基因，所以在细胞的培养液中加入800单位/毫升的G418抗生素，每次传代或更换培养液时均补充800单位/毫升的G418，持续2周，此时没有转染目的基因的细胞因为没有抗性基因，被G418抗生素杀死，所以剩余细胞全部是成功转入bcl-2和erbB-Ι基因的细胞。[0027]3、建立肿瘤细胞系:细胞进行苏木精-伊红染色，发现细胞核较大，核浆比倒置，存在三级/多级有丝分裂现象；软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可在软琼脂中形成克隆团集落；动物致瘤性试验结果显示，裸鼠皮下接种5X IO8筛选后细胞，2周后，可以形成实体瘤块。综上，筛选后细胞可以鉴定为肿瘤细胞。[0028]待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集IO7肿瘤细胞，用5毫升培养基重悬，然后反复冻融，使细胞彻底裂解，将裂解液加入提前培养到第6天的患者DC细胞中，48小时后，收集刺激致敏的DC细胞加入到患者CIK细胞中，24小时后，收集CIK细胞作为效应细胞，用患者肿瘤细胞作为祀细胞，测定杀伤活性。结果经个体化肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤，在效靶比为5:1的条件下，可以达到28.6%，远高于未致敏组(13.7%)。
[0029]实验例2
[0030]从胃腺癌手术样品分离浓缩肿瘤细胞:用手术剪去除脂肪组织和血管；用RPMI1640培养基冲洗剩余肿瘤组织；用手术剪将肿瘤组织剪成小块，然后用粗头吸管研磨并反复吹打，过100目筛网，去除剩余的较大的团块。将细胞悬液300g离心5分钟，弃上清；细胞沉淀用5毫升的RPMI1640培养基重悬；将细胞悬液轻轻加在5毫升密度为1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分离液上，800g离心15分钟；从液体界面中间收集白色细胞层，将细胞用肿瘤细胞专用培养基稀释到2xl06个细胞/毫升，接种到24孔细胞培养板，每孔1.5毫升。
[0031]2、基因转染:将bcl-2和erbB-Ι基因片段分别插入到慢病毒载体pEFlalpha-1RESVector (购自clontech)的两个多克隆位点，构建目的基因载体；提前24小时将5X IO6个Lent1-X293T包装细胞接种到10厘米的培养皿中；将适量的目的基因载体与36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5 微升 Xfect Polymer, 1150 微升 Xfect Reaction Buffer混合后，室温静置10分钟，然后加入到培养皿中；将培养皿至于37° 二氧化碳培养箱中过夜；更换新的培养基；48小时后，收集上清液，过0.45微米的无菌滤膜，过滤液即为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5.2 X IO7单位/毫升。
[0032]肿瘤细胞培养4天后，观察细胞贴壁良好，状态稳定。将步骤2中的病毒悬液加入到肿瘤细胞的24孔培养板中，500微升/孔。
[0033]扩大培养:在转染3天后，观察到细胞开始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，进行细胞传代；每3天进行一次传代操作。
[0034]抗性筛选:进行5次传代培养后，开始抗性筛选。因为pEFlalpha-1RES Vector中带有neo抗性基因，所以在细胞的培养液中加入800单位/毫升的G418抗生素，每次传代或更换培养液时均补充800单位/毫升的G418，持续2周，此时没有转染目的基因的细胞因为没有抗性基因，被G418抗生素杀死，所以剩余细胞全部是成功转入bcl-2和erbB-Ι基因的细胞。
[0035]筛选后细胞鉴定:筛选后的细胞进行苏木精-伊红染色，发现细胞核较大，核浆比倒置，存在三级/多级有丝分裂现象；软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可在软琼脂中形成克隆团集落；动物致瘤性试验结果显示，裸鼠皮下接种5 X IO8筛选后细胞，2周后，可以形成实体瘤块。综上，筛选后细胞可以鉴定为肿瘤细胞。
[0036]待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集IO7肿瘤细胞，用5毫升培养基重悬，然后反复冻融，使细胞彻底裂解，将裂解液加入提前培养到第6天的患者DC细胞中，48小时后，收集刺激致敏的DC细胞加入到患者CIK细胞中，24小时后，收集CIK细胞作为效应细胞，用患者肿瘤细胞作为祀细胞，测定杀伤活性。结果经个体化肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤，在效靶比为5:1的条件下，可以达到34.1%，远高于未致敏组(14.5%)。
[0037]实验例3
[0038]从非小细胞肺癌分离浓缩肿瘤细胞:用手术剪去除脂肪组织和血管；用RPMI1640培养基冲洗剩余肿瘤组织；用手术剪将肿瘤组织剪成小块，然后用粗头吸管研磨并反复吹打，过100目筛网，去除剩余的较大的团块。将细胞悬液300g离心5分钟，弃上清；细胞沉淀用5毫升的RPMI1640培养基重悬；将细胞悬液轻轻加在5毫升密度为1.055mg/ml的蔗聚糖一泛影葡胺分离液上，800g离心15分钟；从液体界面中间收集白色细胞层，将细胞用肿瘤细胞专用培养基稀释到2xl06个细胞/毫升，接种到24孔细胞培养板，每孔1.5毫升。
[0039]病毒制备:将bcl-2和erbB-Ι基因片段分别插入到慢病毒载体pEFlalpha-1RESVector (购自clontech)的两个多克隆位点，构建目的基因载体；提前24小时将5X IO6个Lent1-X293T包装细胞接种到10厘米的培养皿中；将适量的目的基因载体与36微升Lent1-X HTX Packaging Mix, 7.5 微升 Xfect Polymer, 1150 微升 Xfect Reaction Buffer混合后，室温静置10分钟，然后加入到培养皿中；将培养皿至于37° 二氧化碳培养箱中过夜；更换新的培养基；48小时后，收集上清液，过0.45微米的无菌滤膜，过滤液即为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5.2 X IO7单位/毫升。
[0040]基因转染:肿瘤细胞培养4天后，观察细胞贴壁良好，状态稳定。将步骤2中的病毒悬液加入到肿瘤细胞的24孔培养板中，500微升/孔。
[0041]扩大培养:在转染3天后，观察到细胞开始快速增殖。用0.25%胰蛋白酶酶解，进行细胞传代；每3天进行一次传代操作。
[0042]抗性筛选:进行5次传代培养后，开始抗性筛选。因为pEFlalpha-1RES Vector中带有neo抗性基因，所以在细胞的培养液中加入800单位/毫升的G418抗生素，每次传代或更换培养液时均补充800单位/毫升的G418，持续2周，此时没有转染目的基因的细胞因为没有抗性基因，被G418抗生素杀死，所以剩余细胞全部是成功转入bcl-2和erbB-Ι基因的细胞。
[0043]筛选后细胞鉴定:筛选后的细胞进行苏木精-伊红染色，发现细胞核较大，核浆比倒置，存在三级/多级有丝分裂现象；软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可在软琼脂中形成克隆团集落；动物致瘤性试验结果显示，裸鼠皮下接种5X IO8筛选后细胞，2周后，可以形成实体瘤块。综上，筛选后细胞可以鉴定为肿瘤细胞。
[0044]待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集IO7肿瘤细胞，用5毫升培养基重悬，然后反复冻融，使细胞彻底裂解，将裂解液加入提前培养到第6天的患者DC细胞中，48小时后，收集刺激致敏的DC细胞加入到患者CIK细胞中，24小时后，收集CIK细胞作为效应细胞，用患者肿瘤细胞作为祀细胞，测定杀伤活性。结果经个体化肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤，在效靶比为5:1的条件下，可以达到22.9%，远高于未致敏组(12.2%)。
[0045]本发明所制备的个体化肿瘤细胞系，可以传代15次以上。将此细胞系用于刺激患者DC细胞致敏，致敏后的DC细胞将抗原递呈CIK细胞后，可以使CIK细胞的杀伤活性提高超过100%。
【权利要求】
1.一种肿瘤细胞系的构建方法，包括如下的步骤: O从肿瘤组织分离浓缩肿瘤细胞:用RPMI 1640培养基冲洗肿瘤组织；再用将肿瘤组织剪碎研磨后离心收集肿瘤细胞；用RPMI 1640培养基重悬肿瘤细胞制成细胞悬液；将细胞悬液加在肿瘤细胞分离液上，离心后从液体界面中间收集白色细胞层，将收集细胞用RPMI 1640培养基稀释后接种到细胞培养板中； 2)基因转染:细胞贴壁后，将含有特定基因的慢病毒加入到细胞培养板中进行转染，病毒滴度大于IO7单位/毫升； 3)将基因转染后的肿瘤细胞培养基进行培养，培养3-5天后，将培养的肿瘤细胞用胰蛋白酶酶解，进行细胞传代建立肿瘤细胞系。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)中特定基因为bcl-2基因和erbB-Ι基因，所述的bcl-2基因核苷酸序列为SEQ ID NO:1 ;erbB_l基因核苷酸序列为SEQID NO:3。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤3)中的肿瘤细胞培养基，其配方组成如下:硝酸韩100mg/L,氯化钾400.00mg/L,硫酸镁48.80mg/L,氯化钠6000.00mg/L,碳酸氢钠 2000mg/L，磷酸二氢钠 677.00mg/L、L-精氨酸 200.00mg/L, L-天冬酰胺 56.80mg/L, L-天冬氨酸 20.00mg/L, L-胱氨酸 49.8mg/L, L-谷氨酸 20.00mg/L,甘氨酸 10.00mg/L,L-组氨酸 15.00mg/L, L-轻脯氨酸 20.00mg/L, L-异亮氨酸 50.00mg/L, L-亮氨酸 50.0Omg/L, L-赖氨酸盐酸盐40.0mg/L, L-蛋氨酸15.00mg/L, L-苯丙氨酸15.00mg/L, L-脯氨酸 20.00mg/L, L-丝氨酸 30.00mg/L, L-苏氨酸 20.00mg/L, L-色氨酸 5.00mg/L, L-酪氨酸20.00mg/L, L-缴氨酸20.00mg/L,对氨基苯甲酸1.00mg/L,生物素0.20mg/L,氯化胆碱 3.00mg/L,维生素 B120.005mg/L,叶酸 1.00mg/L,肌醇 35.00mg/L,烟酰胺 1.00mg/L,泛酸钙0.25mg/L,盐酸吡卩多醇1.00mg/L,核黄素0.20mg/L,盐酸硫胺素1.00mg/L,葡萄糖2000.00mg/L，谷胱甘肽 1.0.mg/L，酚红 5.0mg/L。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的肿瘤细胞培养基中添加了表皮生长因子0.01mg/L,胰岛素8mg/L,转铁蛋白50mg/L,三碘甲腺原氨酸0.005mg/L。
【文档编号】C12N15/867GK103468746SQ201310452611
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月28日 优先权日:2013年9月28日
【发明者】徐矫健, 孙威 申请人:青岛麦迪赛斯生物科技有限公司