一种生物发酵有机肥及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物有机肥发酵复合菌剂，其含有淀粉霉（Amylomyces?rouxii）、青霉属菌（Penicillium?cordubense）、嗜冷枯草芽孢杆菌（Bacillus?phychrophilus）。在种养殖废弃物堆体中接种本发明的生物有机肥发酵复合菌剂，在北方低温季节能迅速提高堆体温度，且能使堆体保持50℃以上的高温15天左右，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。由此生产的有机肥发酵彻底，养分含量高，可作为优良的植物有机肥使用。
【专利说明】一种生物发酵有机肥及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于资源利用领域，具体涉及一种生物发酵有机肥及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着百姓对畜禽产品需求的日益增加，我国畜禽养殖量每年以超过10%的速度增长，并逐渐集中在经济发达、交通便利、市场需求大的大中城市及沿海地区。但同时大量畜禽粪污却不能得到有效处置和利用，引发了一系列环境和生态问题，如造成水体面源污染加剧、土壤中污染物累积等，已引起公众和政府普遍关注。2013年中共中央国务院一号文件再次重申了“强化农业生产过程环境监测，积极开展农业面源污染和畜禽养殖污染防治”工作。因此，在确保畜禽养殖产业有效发展、确保农民收入的前提下，有效地处置、利用畜禽废弃物、减少环境和生态的污染风险迫在眉睫。
[0003]目前，国内外在畜禽粪便的处理中以好氧处理(高温堆肥)、厌氧处理(沼气)和焚烧处理(灰化)为主。我国利用各种技术处理畜禽粪便以期实现减量化、无害化、资源化的目的，目前我国对畜禽粪便的加工处理方法主要集中在以下三种:饲料化、能源化、肥料化等。
[0004]I)饲料化。畜禽粪便中不仅含有大量未消化的蛋白质、维生素而且还有一定数量的糖类物质和丰富的氨基酸种类。为了满足畜牧业市场的饲料供应，开发出具有较高的蛋白质含量和齐全的氨基酸种类的饲料来源是目前最首要任务。国内外大量研究结果表明，鸡粪不仅是反刍动物良好的蛋白质补充料，也是单胃动物和鱼类良好的饲料蛋白来源，鸡粪已经成为最受关注的一种非常规饲料资源。
[0005]2)能源化。能源化有两种手段:焚烧和厌氧发酵。将畜禽粪便直接投入专用炉下充分燃烧成为灰渣，产生的热量可用于发电等。这种方法可使畜禽粪便在较短时间内减量90%以上，并杀灭粪便中的有害`病菌和虫卵。但投资大，处理费用昂贵，燃烧时释放大量C02和其它有害气体，对大气环境有不良影响，同时一些有利用价值的营养元素被烧掉，造成再生资源的浪费。目前研究最多、最有发展前途的是通过厌氧消化工艺获得沼气。厌氧发酵生产沼气，为生产生活提供能源，同时沼渣和沼液又是很好的有机饲料和肥料，这样既减少了污染，又提高了污染物治理的经济效益。但较大规模的厌氧处理沼渣沼液需深化利用才能排放。
[0006]3)肥料化。目前，利用畜禽粪便生产有机肥是备受人们欢迎的方式，不仅解决了污染问题而且还能最大限度的废物资源化利用。堆肥过程产生的高温能够杀死大量病原微生物、杂草种子和害虫，使有机物达到无害化和资源化的利用，除此之外，堆肥结束后生产的有机肥还能够为大量的农作物提供必需的N、P、K等营养成分和有机质，成为农业发展的宝贵资源。肥料化尤其适宜推广种养循环的经济模式，以彻底理顺粪污消解输出的渠道，使畜禽养殖业生产废弃物的综合利用和粪污治理处于一个完整的系统工程中，具有运行成本相对较低、处理方式灵活方便的优势。
【发明内容】
[0007]本发明首先提供一种用于生物发酵有机肥的生物菌剂。
[0008]本发明提供的生物发酵有机肥复合菌剂,其含有淀粉霉(Amylomyces rouxii)、青霉属菌(Penicillium cordubense)、嗜冷枯草芽抱杆菌(Bacillus phychrophilus)。
[0009]其中，所述的淀粉霉的保藏号为CGMCC N0.6874。
[0010]其中，所述的青霉属菌的保藏号为CGMCC N0.6876。
[0011]本发明不限定嗜冷枯草芽孢杆菌的菌株号，现有公布的嗜冷枯草芽孢杆菌均可用于本发明，如公布于王亮，牛粪好氧堆肥中微生物多样性及生产应用研究，2012，北京林业大学。
[0012]其中，所述淀粉霉的活菌数为10亿/克以上，所述的青霉属菌的活菌数为20亿/克以上，所述嗜冷枯草芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上。
[0013]在本发明一个实施方案，所述的生物菌剂可以为液体菌剂。
[0014]本发明还提供一种生物发酵有机肥的制备方法，用粉碎的农作物秸杆将畜禽粪便的C/N比调整到28-32，含水量调整至60-65%，按5_8%。的比例接入所述的生物菌剂，当堆体温度高于55度时，翻堆通气，经过20-30天好氧高温发酵。
[0015]本发明的淀粉霉和青霉属菌菌株分离与筛选过程如下:
[0016]①采用平板稀释法分别从新鲜牛粪、不同发酵阶段牛粪以及腐熟后的牛粪中进行微生物分离。称取各样品各IOg分别放入装有90mL无菌水的三角瓶中，在摇床上振荡30min，使样品充分分散，静置20min后即为KT1稀释液，然后连续稀释制成10_2_10_8浓度的稀释液备用。取100 μ L各浓度的稀释液，采用常规涂抹法用涂布器在改良高氏I号固体培养基上涂布，每个浓度梯度三个重复，分别置于25°C、35°C、50°C恒温培养箱中培养。3d后挑取平板上长出的单菌落，进一步纯化培养，并于4°C保存。
[0017]改良高氏I号培养基，其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L 0g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂
1.5%-2.0%。
[0018]②根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株中温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第4天D/d达到10.7。该菌株菌落边缘不整齐绒毛长，草丛状，洁白色，毛上有黑色孢子。
[0019]③测定该菌株的ITS序列进行分子生物学鉴定，所用引物为ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.1所示，与其它公布的淀粉霉的ITS序列同源性为99%以上，鉴定为淀粉霉(Amylomyces rouxii),命名为CZl,并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.6874。
[0020]④根据菌株在纤维素一刚果红平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈与菌落直径比值(D/d)的大小，筛选出了 I株低温菌，该菌株在培养的第2天即出现清晰的透明圈，在培养第4天D/d达到9.2。该菌株菌落灰绿色，周边乳白色，短绒毛状，反面肉色，营养菌丝树根状，生长较快。
[0021]⑤测定该菌株的ITS序列进行分子生物学鉴定，所用引物为ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.4所示,与其它公布的青霉属菌(Penicillium cordubense)的ITS序列同源性为99%以上，鉴定为青霉属菌(Penicillium cordubense)，命名为CZ2，并于2012年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.6876。
[0022]本发明的淀粉霉新菌株CZ1，能在环境温度为8°C左右的条件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆体保持50°C以上的高温15天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥产物养分含量高，PH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。
[0023]本发明的青霉属菌(Penicillium cordubense)CZ2,能在环境温度为8°C左右的条件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆体保持50°C以上的高温15-18天，缩短了发酵周期，能有效杀灭动物粪便中的病原物和寄生虫。堆肥发酵结束后，堆肥产物养分含量高，PH8.0左右，可作为优良的植物有机肥使用。
[0024]本发明所述的生物发酵有机肥复合菌剂可以在环境温度为5°C左右的低温环境下用于畜禽粪便堆肥处理，使我国北方地区有机肥生产每年可连续进行10-15个周期，每个生产周期20天左右完成。堆肥产物的养分含量均高于标准NY-525-2012中的规定，重金属含量远远低于标准NY-525-2012中的规定。项目生产的肥料在多种植物上施用后，均能促进植物的生长发育，提闻植物广品的品质。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1所示为堆肥过程中堆料的温度变化。
【具体实施方式】
[0026]以下实施例用于说明`本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027]若无特别说明，本发明中所述的“份”是指“重量份”。
[0028]实施例1生物有机肥发酵复合菌剂的制备
[0029]I)淀粉霉CZl发酵
[0030]将淀粉霉CZl接种至改良高氏I号固体培养基斜面，于35°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0031]将斜面种子接种至改良高氏I号液体培养基，于35°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0032]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，35°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0033]所述的改良高氏I号固体培养基成分为:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂2.0%，分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。
[0034]所述的改良高氏I号液体培养基成分同前，无琼脂。[0035]2)青霉属菌(Penicillium cordubense) CZ2 发酵
[0036]将青霉属菌CZ2接种至改良高氏I号固体培养基斜面，于25°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0037]将斜面种子接种至改良高氏I号液体培养基，于25°C恒温条件，180r/min转速振荡培养72h得到液体种子；
[0038]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，25°C恒温培养4天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0039]所述的改良高氏I号固体培养基成分为:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、琼脂2.0%，分装入试管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高温高压灭菌20min，之后摆成斜面。
[0040]所述的改良高氏I号液体培养基成分同前，无琼脂。
[0041 ] 3 )嗜冷枯草芽孢杆菌发酵
[0042]将嗜冷枯草芽孢杆菌(王亮，2012)接种至牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面，于37°C恒温条件培养72h得到斜面种子；
[0043]用接种针挑取斜面菌落，接种至带牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中，在35°C，160r/min条件下培养12h得到种子液。
[0044]将液体种子以5% (V/V,即每100ml液体培养基接种5ml液体种子)接种量,接种到液体发酵罐中的生产培养基中，进行菌种生产，于持续通气条件下，35°C，160r/min条件下培养2天。培养后的发酵液即可作为菌剂使用。
[0045](4)将淀粉霉CZl发酵液、青霉属菌CZ2发酵液、嗜冷枯草芽孢杆菌发酵液按重量比，1:2:1进行混合，即得本发明的生物发酵有机肥复合菌剂，其中淀粉霉的活菌数为10亿/克以上，所述的青霉属菌的活菌数为20亿/克以上，所述嗜冷枯草芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上。
[0046]实施例2生物有机肥制备方法
[0047]在环境温度5°C左右的低温条件下，将新鲜牛粪与粉碎秸杆以一定比例进行混合，调整堆料的C/N为30，含水量为65%。
[0048]将实施例1生产的菌剂按照质量比8%。接种到堆料混合物中，堆体温度高于55度时，翻堆通气，进行堆肥发酵。同时以不接入本发明的菌剂的堆体为对照。
[0049]监测发酵过程中堆料的温度变化，并于发酵结束后，测定堆肥产物的养分含量和种子发芽指数(GI)。
[0050]测定方法:堆肥样品养分含量根据有机肥料农业行业标准(NY-525-2012)进行测定。采用H2SO4-H2O2联合消煮,全氮采用Kjeltec2300型凯氏定氮仪测定,全磷采用钥;钥黄比色法分光光度计测定，全钾火焰光度法FP6410型火焰光度计测定。堆肥样品有机碳含量采用灼烧法测定。
[0051]堆肥结束后用小土钻多点钻取堆体中部样品，每处理采样500g，混合均匀，然后采用四分法取样200g。称取50g加250ml蒸懼水混合搅拌30min后，经3000r/min离心lOmin，上清液即为堆肥浸提液。在直径9cm铺有滤纸的无菌培养皿中，均匀放入20粒白菜(Brassica campestris L.)种子,吸取5ml堆肥浸提液润湿滤纸，以蒸懼水作对照，每个处理3次重复，在25°C恒温培养箱中培养24h，测定种子发芽率和根长，并计算种子发芽指数。
[0052]GI(%)=处理平均发芽率X处理平均根长/(对照平均发芽率X对照平均根长)X 100。
[0053]从堆肥过程中堆料的温度变化情况(图1)可以看出，在环境温度为5°C左右的低温条件下，添加本发明复合菌剂与未接菌对照的堆体温度均呈现出先上升后下降的趋势，物料在堆积初期由于微生物的活动逐渐分解，释放热量，不断提高了堆内温度。接菌的处理在第2d达到50°C以上，第Ild达到最高温，为60.3°C，而CK在整个发酵期间始终未达到50°C，其在第IOd达到最高温43.1°C。从升温速度和最高温来看，添加本发明菌剂的处理均高于CK。堆肥温度在55°C条件下保持3d以上(或50°C以上保持5-7d)，是杀灭堆肥所含致病微生物和害虫卵，保证堆肥的卫生指标合格和堆肥腐熟的重要条件。接种本发明复合菌剂的处理堆料维持55°C以上的时间为9d，达到了无害化标准，而CK处理的堆料未达到无害化标准。随着有机物的消耗，微生物的代谢活动减慢，自身产热量减少，并由于环境温度较低，从而导致堆体的温度迅速下降至20°C左右，并在堆肥结束后，堆体温度稳定在20°C左右。
[0054]种子发芽指数(GI) ≥80%，说明有机肥料对植物无毒性并已达到腐熟。测定发酵20天时两个处理堆料的种子发芽指数(见表1)，接种本发明复合菌剂的堆肥处理，在第20天，其种子发芽指数为90.7%，说明此时堆料已完全腐熟。而未接菌(CK)堆料，种子发芽指数为65.4%，说明发酵不彻底。
[0055]测定发酵20天时堆料的养分含量(见表1)可以看出，接种本发明复合菌剂的堆料其有机质和全效氮磷钾的含量均显著高于未接菌的对照(CK)，其总养分含量是CK的2倍，达到并高于NY-525-2012中有机肥质量的标准。而未接菌(CK)堆料，养分含量未达到NY-525-2012中有机肥质量的标准。
[0056]表1堆肥样品的种子发芽指数和养分含量
【权利要求】
1.一种生物有机肥发酵复合菌剂，其含有淀粉霉(Amylomyces rouxii )、青霉属菌(Penicillium cordubense)、嗜冷枯草芽抱杆菌(Bacillus phychrophilus)。
2.如权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述的淀粉霉的保藏号为CGMCCN0.6874。
3.如权利要求1所述的生物菌剂，其特征在于，所述的青霉属菌的保藏号为CGMCCN0.6876。
4.如权利要求1~3任一项所述的生物菌剂，其特征在于，所述淀粉霉的活菌数为10亿/克以上，所述的青霉属菌的活菌数为20亿/克以上，所述嗜冷枯草芽孢杆菌的活菌数为10亿/克以上。
5.如权利要求1~4任一项所述的生物菌剂，其特征在于，其为液体菌剂。
6.—种生物发酵有机肥制备方法，其特征在于，用粉碎的农作物秸杆将畜禽粪便的C/N比调整到28-32，含水量调整至60-65%，按5-8%。的比例接入权利要求1~5任一项所述的生物菌剂，当堆体温度高于55度时，翻堆通气，经过20-30天好氧高温发酵。
7.制备权利要求6所述的制备方 法制备的生物发酵有机肥。
【文档编号】C12R1/07GK103497899SQ201310454820
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】刘克锋, 王顺利, 王红利, 高程达, 石爱平 申请人:北京农学院