水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻OsDRAP1基因在增强植物抗旱性中应用。本发明提供了序列表中序列2所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用、序列表中序列2所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用。本发明的实验结果表明，OsDRAP1基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；OsDRAP1转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC?box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsDRAP1基因能够在一定程度上改善水稻抗旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
【专利说明】水稻OsDRAPI基因在增强植物抗旱性中应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】中水稻AP2/EREBP转录因子家族基因OsDRAPI在增强植物抗旱性中应用。
【背景技术】
[0002]各种生物和非生物胁迫是影响水稻生长和产量的重要因素，发掘能够改善水稻抵抗逆境胁迫能力的基因将为基因工程改良水稻新品种打下基础。在长期进化过程中，植物在分子、细胞、生理和生物化学水平上发展出多种机制应对逆境胁迫，转录因子作为上游调控基因在植物的胁迫应答途径中扮演重要的角色。植物中参与胁迫应答反应的主要有AP2/EREBP、bZIP、NAC、MYB和WRKY转录因子家族。其中AP2/EREBP转录因子家族基因广泛参与植物的发育、激素信号转导、病原反应与干旱、高盐及低温等胁迫应答反应。该家族转录因子的共同特点是含有一个60个氨基酸左右的AP2结构域，它在与DNA结合中具有重要的作用。根据AP2结构域的特点，AP2/EREBP转录因子家族被分为:AP2、EREBP, RAV和其它共4个亚类。AP2成员含有2个重复的AP2结构域，而RAV成员含一个AP2结构域和一个类似B3结构域；EREBP亚家族成员含有一个AP2结构域，且有ERF和DREB/CBF两个分支。
[0003]研究表明，EREBPs转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫应答反应。ERFs类转录因子主要参与植物的生物胁迫应答反应，如病原反应、伤害反应、乙烯信号途径。最早发现的ERF转录因子是从烟草中分离得到的4个乙烯诱导病程相关(pathegenesis-related, PR)蛋白EREBP1-4,它们通过结合下游基因启动子区域的乙烯应答元件GCC box调控下游基因的表达。GCC box广泛存在于烟草和其他植物PR蛋白基因的
UTR区域，核心序列是AGCCGCC。1997年，Zhou等在番茄中发现3个ERF蛋白(Pti_4、Pt1-5和Pt1-6)能够和疾病防御蛋白Pto相互作用，进一步验证了 ERFs转录因子在植物的病原反应中具有重要作用。在植物中超表达一些ERFs基因亦能够提高植物的抗病能力，如ERFKPti4,ATERFI基因。最近的研究表明水稻中的ERF转录因子在乙烯应答、淹水胁迫应答、干旱胁迫应答等多种生物途径中起着正向调节作用。
[0004]DREBs转录因子在植物的冷、干旱、高盐、过氧化物等胁迫应答途径中具有重要的作用，参与不依赖于ABA的胁迫应答反应。DREBs转录因子通过结合下游基因启动子区的干旱应答顺式作用元件DRE/CRT而调控下游基因的表达。干旱应答顺式作用元件DRE(dehydration-responsive element)最早在逆境胁迫诱导基因rd29A的启动子区域被发现，核心序列为A/GCCGAC。与DRE相似的顺式作用元件CRT (C-repeat)则是在一个冷诱导基因corl5a的启动子区被发现，其核心序列是TGGCCGA。DRE/CRT被发现存在于多个受干旱和低温诱导的基因的启动子区域。在拟南芥、水稻等植物中超表达DREB家族的基因大多能提高植株应对非生物胁迫的能力。迄今为止，越来越多的DREBs基因从不同植物中被克隆。在水稻中发现的DREB基因有0sDREBlA-G、0sDREB2A、0sDREB2B，其中OsDREBlA、OsDREBIE, OsDREBIG、0sDREB2A、0sDREB2B能够特异性地结合DRE。研究发现在拟南芥中超表达OsDREBlA能够提高拟南芥植株耐受低温、高盐和干旱的能力(Dubouzet J G, SakumaY, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet E G,Miura S, Seki Μ, Shinozaki K, Yamaguch1-ShinozakiK.0sDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators thatfunction in drought-, high-salt—and cold-responsive gene expression.Plant J,2003，33:751-763);在水稻中超表达OsDREBIG和0sDREB2B也能够明显地提高转基因水稻的抗旱性，而超表达OsDREBlE仅仅能够轻微地提高水稻抵抗干旱的能力(Chen J Q，MengX P, Zhang Y, Xia M, Wang X P.0ver-expression of OsDREB genes lead to enhanceddrought tolerance in rice.Biotechnol Lett,2008,30(12):2191-2198)。
[0005]ERFs和DREBs转录因子功能的差异主要体现在它们能够结合的顺式作用元件和调节的下游基因不同。有些EREBPs转录因子既能结合DRE，也能结合GCCbox，如TINY、TINY2、BnDREBIII, AtERFU AtERF4、AtEBP 和 CBFl ;而部分只能结合 DRE,如 CBF2/DREBlC和CBF3/DREB1A等。ERFs转录因子倾向于结合GCC box, DREBs转录因子则倾向于结合DRE。为了发掘影响两类转录因子结合的关键氨基酸，Sakuma等(Sakuma Y,Liu Q, Joseph G.DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of ArabidopsisDREB, transcription factors involved in dehydration-and cold—inducible geneexpression.Biochem Biophy Res Commun, 2002, 290:998-1009)通过多序列比对分析发现拟南芥中的DREBs转录因子的AP2结构域第15和第20个氨基酸分别是缬氨酸(Val，V)和谷氨酸(Glu，E)，而ERFs转录因子的AP2结构域第15和20个氨基酸是丙氨酸(Ala，A)和天冬氨酸(Asp，D)，进一步研究表明Val-15和Glu_20特别是Val_15对于结合DRE有重要的作用，但不影响对GCC box的结合,这可能是造成ERFs和DREBs转录因子功能不同的原因。为了发掘影响GCC box结合的关键氨基酸，孙山等(Sun S，Yu J P, Chen F，Zhao TJ, Fang X H, Li Y Q, Sui S F.TINY, a dehydration-responsive element(DRE)-bindingprotein-like transcription factor connecting the DRE—and ethylene-responsiveelement-mediated signaling pathways in Arabidopsis.Biol Chem,2006,283:6261-6271)比较能够结合两种顺式作用元件的蛋白序列和只能结合DRE的蛋白序列发现两类蛋白的AP2保守区的第16个氨基酸不同，进一步研究表明Ser-16对于拟南芥中的DREB转录因子TINY结合GCC box是必不可少的。TINY既参与生物胁迫反应途径，也参与非生物胁迫途径，说明DRE介导的调控途径和GCC box介导的调控途径存在一定的重叠。
[0006]水稻中有些AP2/EREBP转录因子基因在受到非生物胁迫时表达量明显升高，其中大部分基因为DREBs和ERFs，这些基因很有可能与水稻的非生物胁迫应答反应相关。虽然近年来对于EREBPs转录因子参与非生物胁迫应答反应的机制有了较全面的研究，但是水稻中还有很多的EREBPs基因的功能未知。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供序列表中序列I所示的蛋白及其编码基因(OsDRAPl)。
[0008]本发明提供了序列表中序列I所示的蛋白及其编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因；
[0009]1)序列表中序列2、3的自5'末端第505位-1347位所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子；
[0011]3)在严格条件下与I)所不的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；[0012]4)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
[0013]含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014]所述重组表达载体的构建过程中,在其转录起始核苷酸前加上4个Myc蛋白标签，在pCUbil390的多克隆位点间，即Ubiquitin启动子后插入所述序列表中序列I所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
[0015]所述植物为单子叶植物-水稻，包括双子叶植物。
[0016]本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列I所示的蛋白的编码基因导入植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比抗旱性增强。
[0017]本发明通过干旱、高盐、低温胁迫下OsDRAPl基因在不同水稻品种中的表达差异，结合凝胶阻滞实验中其对顺式元件GCC box和DRE的结合情况，以及超表达和RNAi抑制表达水稻植株的表型变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻非生物胁迫应答的关系。结果表明，OsDRAPl基因在受到高盐和干旱胁迫时表达量迅速增加，但受到低温胁迫时增加幅度较小；0sDRAPl转录因子可以通过结合下游基因启动子区域的GCC box和DRE来调控下游基因的表达，参与植物胁迫应答反应；在水稻中超表达OsDRAPl基因能够显著改善水稻抵御干旱胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻抗逆性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要的理论和实际意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为以实时定量PCR分析OsDRAPl在非生物胁迫下的表达量差异。
[0019]图2为以实时定量PCR分析OsDRAPl在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达量差平。
[0020]图3为以实时定量PCR分析OsDRAPl在不同组织中的表达模式。
[0021]图4为OsDRAPl的AP2结构域结合GCC box和DRE元件的EMSA分析图谱。
[0022]图5为PCR检测转基因T-DNA插入及qPCR、Westren blot检测目的基因表达水平。
[0023]图6为超表达OsDRAPl和RNAi转基因植株抗旱相关表型。
【具体实施方式】
[0024]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026]实施例1、不同胁迫处理条件下OsDRAPl基因在不同水稻品种中的时空表达差异
[0027]日本晴(Nipponbare,Oryza sativa ssp.japonica)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Yongqing Jiao, Yonghong Wang, DaweiXue，Jing Wang，Meixian Yan，Guifu Liu，Guojun Dong,Dali Zeng,Zefu Lu，Xudong Zhu,Qian Qian and Jiayang Li (2010)Regulation of 0sSPL14by 0smiR156defines idealplant architecture in rice.Nature Genetics，42，541-544)；
[0028]典型耐旱旱稻品种IRAT109(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:San-Hong Liu, Bin-Ying Fu, Hua-Xue Xu, Ling-Hua Zhu,Hu-Qu Zhai,Zh1-Kang Li (2007)Cell death in response to osmotic and salt stressesin two rice(Oryza sativa L.) ecotypes, Plant Science,172,897-902)；
[0029]耐盐水稻FL478(请说明FL478的来源)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:Harkamal ffalia, Clyde Wilson*, PascalCondamine, Xuan Liu, Abdelbagi M.1smail, Linghe Zeng, Steve 1.Wanamaker, JayatiMandal, Jin Xu,Xinping Cui,and Timothy J.Close(2005)Comparative TranscriptionalProfiling of Two Contrasting Rice Genotypes under Salinity Stress during theVegetative Growth Stage.Plant Physiology,139，822-835)；
[0030]耐冷水稻云南地方品种丽江新团黑谷(LTH)(公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，记载过该材料的非专利文献是:凌忠专，雷财林，王久林(2004)稻瘟病菌生理小种研究的回顾与展望，中国农业科学,37 (12): 1849-1859)。
[0031]1、水稻的低温、高盐和干旱胁迫
[0032]水稻日本晴、典型耐旱旱稻品种IRAT109、抗旱水稻品种FL478和耐冷水稻z?南地方品种丽江新团黑谷(LTH)种子经消毒处理，室温浸种2d，37°C催芽ld，萌发后选发芽一致的种子播于塑料盒泡沫架上，每孔2粒，二叶前水培，二叶后用Yoshida营养液培养。于五叶期开始低温(4°C )、高盐(150mmol T1NaCl)和渗透胁迫(20% PEG)处理，日本晴于胁迫处理0h、0.5h、lh、3h、6h、12h、24h后取叶片；IRAT109、FL478、LTH处理两天后分别取根和叶片；取正常生长条件下日本晴的幼穗、成熟叶片、茎、茎节、基座、老根、幼叶、幼根、愈伤组织，液氮速冻，-70°C低温保存，用于RNA提取。
[0033]2、实时定量PCR分析
[0034]采用TRIZOL试剂提取 实验样品总RNA，并进行RNA纯度的分析:用I %琼脂糖凝胶电泳快速检测提取的总RNA的完整性，DNase I消化RNA中的基因组DNA，具体方法和步骤参照说明书。
[0035]反转录:
[0036]第一链cDNA的合成用反转录用试剂盒(Promega公司，Code no:A3500)。
[0037]Real Time PCR 分析:
[0038]Real Time PCR 分析，所用 OsDRAPl 的 PCR 引物如下:F:5' -TGGTCTGATTTGGTAGCC-3' ；R:5/ -TCCAA GAACTGGCAGACGA-3';内参基因 Actinl 引物序列为 F:5' -GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3' ；R:5/ -GG CTGGAAGAGGACCTCAGG-3' ?RealTime PCR 的分析使用 TaKaRa 的 SYBR Premix Ex Taq 试剂盒(Code no:DRR041A)，应用的Real Time PCR扩增仪为ABI7300，方法见说明书。
[0039]数据分析:
[0040]用相对定量法计算目的基因相对表达量Rel.Exp = 2_Λ'其中Λ Λ Ct =[(待测样品目的基因的Ct-待测样品看家基因的Ct)-(对照组目的基因的Ct-对照组看家基因的 Ct)]。
[0041]标准方差的计算用Excel完成，先用统计函数STDEV算出样品和对照的S值，再将两个S值算平方，算出(SpS22) /3的值，进而算出X = Power ((S1^S22) /3,0.5)，最后算出方
^— (2 (-ddct-X) _2 (-ddct+x))丨[0042]结果表明日本晴中OsDRAPl在低温、高盐、PEG和旱胁迫下的表达量变化谱:结果如图1所示(图1中，cold:4°C处理(低温胁迫)；NaCl:150mM NaCl处理(盐胁迫)；PEG:20 % PEG处理(渗透胁迫)，从图中可见，在3种胁迫下OsDRAPI表达量都有增高，但是表达模式存在差异。在低温和PEG胁迫下，OsDRAPl表达量均呈逐渐上升趋势，并在胁迫处理3h达最高水平。然而相比于低温胁迫，在PEG胁迫下OsDRAPl表达量增加幅度较大，并且在胁迫后期仍能保持较高水平。在盐胁迫下OsDRAPl呈逐步升高的趋势，并且表达量变化幅度较大，最高点到达20倍以上。以上结果表明OsDRAPl参与水稻对低温、盐和干旱胁迫的早期应答，并在应答模式上存在差别。[0043]OsDRAPl在典型抗逆水稻品种中胁迫前后的表达差异:结果如图2所示(N:日本晴；L:丽江新团黑谷；F:FL478 ；I:IRAT109)，图2A:冷胁迫下OsDRAPl在日本晴(N)和丽江新团黑谷(L)中的表达量差异；图2B:盐胁迫下OsDRAPl在日本晴和FL478 (F)中的表达量差异；图2C:干旱胁迫下OsDRAPl在日本晴和IRAT109(I)中的表达量差异。结果表明无论是在叶片中还是在根系中，OsDRAPl在典型抗逆水稻品种中的表达模式与日本晴基本相同，而且在胁迫前后的表达量和日本晴相比差异也不太显著。然而，在胁迫前后OsDRAPl在叶和根中的表达量变化稍有差异，在低温和干旱胁迫下，OsDRAPl在根中的表达量增幅高于叶片；在盐胁迫下，OsDRAPl在叶片中的表达量增幅高于根系。
[0044]OsDRAPl组织表达模式(I为幼穗；2为成熟叶片；3为叶鞘；4为茎节；5为节间；6为基座为成熟根；8为幼叶；9为幼根；10为愈伤组织):从图3可以看出，OsDRAPl在水稻所有组织中均表达，但在成熟组织(成熟叶片、成熟根)表达水平高于幼嫩组织。
[0045]实施例2、OsDRAPl可以结合GCC box和DRE顺式元件以调节下游基因的表达
[0046]1、原核表达蛋白的制备
[0047]以PCR扩增出OsDRAPl的AP2保守域(67~193aa)的基因编码序列(即序列表中序列I第703位-1083位所示的核苷酸序列)，并构建到质粒pET-32a(Novagen, USA,69015-3)中，在大肠杆菌 BL2I (DE3)PLysS (TransGen Biotech, China, Cat.No:DR101)中进行蛋白表达，产物经His-trap柱子纯化(GE), Miliproe超滤管浓缩和脱盐后，采用Bradford法测定蛋白浓度。具体方法如下:
[0048](I)PCR扩增目的基因AP2结构域编码区:
[0049]所用弓丨物分别为:OsDRAP1-AP2-F:5/ -GCACTGCAGCAACTCCACATGCAGCGG-3 '(下划线部分为 Pst I 酶切位点)；OsDRAP1-AP2-R:5' -TAAGGATCCCCTGGATGAGGCGTTCTTGG-3;
(下划线部分为BamH I酶切位点)。
[0050]目的基因的扩增采用高保真酶KOD-Plus (Τ0Υ0Β0 Code no:K0D-201)，PCR扩增反应程序为:95°C变性30s，退火30s，72°C延伸(lKb/min) ;34个循环后72°C延伸IOmin, I %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0051]采用TIANGEN公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型，Code no:DP209)，具体操作步骤见产品说明书。利用Pst I和BamH I双酶切并连接插入pET_32a载体中，
[0052]测序结果表明该PCR产物与Gramene数据库中OsDRAPl基因(0s08g31580)序列AP2结构域相同(即序列表中序列I第703位-1083位所示的核苷酸序列)，将重组质粒命名为 pET-32a-DRAPl (AP2)。[0053](2)目的蛋白的制备:
[0054]原核表达目的蛋白的步骤参照分子克隆实验指南，将上述重组质粒pET-32a-DRAPl (AP2)转化到大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS (TransGen Biotech, China, Cat.No:DR101)o 25度，低温诱导表达目的蛋白。
[0055]使用AKTA purifier 仪器和 Iml 的 His-trap HP 柱子(GE, Code N0.17-5247-01)纯化目的蛋白，具体实验步骤按照蛋白纯化系统进行。然后用Mi I iproe4000超滤管脱盐和浓缩蛋白。Bradford法测定蛋白质浓度:测定得到目的蛋白浓度约为I μ g/ μ I。
[0056]2、目的DNA序列及突变序列的制备
[0057]将顺式作用元件GCC box (CATAAGAGCCGCCACT)和突变序列(CATAAGATCCTCCACT)，DRE序列(ATACTACCGACATGAG)和突变序列(ATACTACTGATATGAG)串联重复3次。以化学合成法分别合成双链后，将其等量混合(单链浓度IOOnmol L—1)，95°C温育IOmin后慢慢冷却，复性为双链。
[0058]EMSA实验使用invitrogen的EMSA试剂盒(Code no:E33075)。具体方法和步骤如下:结合反应体系的配制:
[0059]I)在把EMSA试剂盒的组分E (Componentn E)、目的蛋白及目的DNA放置在冰上使
之完全融化。按下列组分配制目的蛋白和目的DNA的结合反应体系:
[0060]
【权利要求】
1.序列表中序列I所示的蛋白在增强植物抗旱性中的应用。
2.序列表中序列I所示的蛋白的编码基因在增强植物抗旱性中的应用；所述蛋白的编码基因为如下I)-4)中任一所述的基因； 1)序列表中序列2、3的自5'末端第505位-1347位所示的DNA分子； 2)序列表中序列2、3所示的DNA和RNA分子； 3)在严格条件下与I)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
3.含有序列表中序列I所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物抗旱性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述重组表达载体为在pCUbil390的多克隆位点间插入所述序列表中序列I所示蛋白的编码基因得到的重组表达载体。
5.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物为水稻。
6.含有权利要求2、3或4所述编码基因的表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述序列表中序列I所示的蛋白的编码基因或与所述基因具有90%以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列导入植物组织、细胞或器官，植物抗旱性获得提高。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。
【文档编号】C12N15/84GK103468740SQ201310465916
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】傅彬英, 黄立钰, 黎志康, 王文生 申请人:中国农业科学院作物科学研究所