一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法

文档序号:520667阅读:492来源:国知局
一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法
【专利摘要】一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,具体操作步骤如下:⑴制备下层无菌培养基;⑵向步骤(1)所得的下层无菌培养基中加入带菌培养基,形成上层带菌培养基;⑶在培养皿反面作2-5个标记,使得每个标记点与平板周缘相距20毫米以上,相邻标记点间距离大于40毫米,用无菌镊子取直径为5毫米的圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使皮革样品的圆心位于标记点处;⑷将步骤(3)所得的接种有试验菌的培养皿放于恒温培养箱中,倒置培养24h或48h后,通过游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径即可。本方法的实验步骤非常简单,能同时测定多个皮革样品的抗菌性能,能大大节约实验时间、成本,减少实验误差,并能保证实验结果的准确性。
【专利说明】一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法
【技术领域】
[0001]本发明属于抗菌消毒测试【技术领域】,具体涉及一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法。
【背景技术】
[0002]皮革是经脱毛和鞣制等物理、化学加工得到的已经变性且不易腐烂的动物皮,其主要成分是交联蛋白质。在制革过程中所使用的原辅材料许多都包含有蛋白质、糖类、脂肪等物质,因此 皮革及其制品中含有丰富的能被微生物利用的营养物质,是微生物良好的寄生地。抗菌皮革,即在皮革中引入一种或几种抗菌基团的功能性皮革材料,使它具有接触杀菌或者抑制皮革表面的微生物繁殖的功能。对皮革的抗菌性能进行科学、快速和准确的检测,是评价抗菌皮革质量优劣的重要指标。
[0003]目前,国内外虽然有很多关于抗菌皮革的研究报道,但评价其抗菌性能的方法都大同小异,且都是参考其他行业标准实施的。其中,评价含有溶出性抗菌剂皮革样品的方法基本上是晕圈法(H.R.Nawaz,.Preparation of Nano Zinc Oxide and itsApplication in Leather as a Retanning and Antibacterial Agent[J].CanadianJournal on Scientific and Industrial Research, 2011, 2 (4): 164-169)以及琼脂培养皿扩散法(邓云霞,杜鹃,朱小卫,任信.皮革材料及其制品抗霉菌效果的方法研究[J].2010,39 (I):22-24).在晕圈法中,用无菌涂布器将菌悬液涂开使其分散于培养基表面,该步骤会花费大量的时间,增加实验的工作量,同时,该步骤还容易引起涂布不均匀,而带来实验误差;在琼脂平皿扩散法中,将菌悬液直接加入无菌培养基里,可避免由于涂布不均匀而带来的实验误差,但是无论是晕圈法还是琼脂培养皿扩散法,在同一个培养皿中,一次只能测试一个样品的抗菌性能,不同样品的抑菌圈直径要用游标卡尺准确量过以后才能得知,且不同的培养环境会带来一定的误差。另外,滤纸条交叉放药法也被用于评价含有溶出性抗菌剂皮革的抗菌性能(Gu Haibin, Zhao Changqing, Chen ffuyong, Li Yan.Evaluating combinations of leather fungicides by inhibition zone[J].Journal ofthe Society of Leather Technologists and Chemists, 2007, 91(2): 63-68),在该方法中,将浸有不同抗菌剂的样品十字交叉放于带菌培养基表面,再根据不同的抑菌区域形状,判断不同的抗菌剂是否有抗菌加合作用或协同作用。虽然该方法能同时测定不同样品的抗菌性能,但是该方法的操作步骤十分繁琐,要求实验者有非常熟练的操作技术;且该方法所需的实验样品面积较大,而皮革样品一般较厚,因此不利于其紧贴培养基表面,从而带来误差。除以上提及的方法以外,关于评价含有溶出性抗菌剂皮革样品抗菌性能的方法报道较少。

【发明内容】

[0004]本发明针对现有测试方法存在的问题,提供了一种简单、快速、能多样品同时测定且测定结果准确、可重复性高的改良晕圈法,用于评价含有溶出性抗菌剂皮革的抗菌性能。[0005]为达到本发明的目的,本发明人在已有的评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能方法的基础上,深入的研究了实验室常用的利用晕圈法以及琼脂培养皿扩散法评价皮革抗菌性能的原理和方法。发现这两种方法虽然都能简单快捷的评价皮革的抗菌性能,但是在晕圈法中,用无菌涂布器将菌液涂开的步骤会花费大量的时间,同时该步骤还可能造成涂布不均匀而带来实验误差。而在琼脂平皿扩散法中,将菌悬液直接加入无菌培养基里,可以避免由于涂布不均匀而带来的实验误差,但是无论是晕圈法还是琼脂培养皿扩散法,在同一个培养皿中,一次只能测试一个样品的抗菌性能。为了简化实验步骤,节约实验时间、成本,提高实验的准确性,本发明人研究了琼脂培养皿扩散法并对其进行了改进,最终发现将菌悬液直接加入培养基里,振荡锥形瓶可使菌悬液均匀的分布在无菌培养基里,形成带菌培养基,然后将带菌培养基倾注于培养皿中可使得菌悬液在平板中均匀的分布,这样即可以减少由于涂布不均匀带来的误差,同时又可以节约大量的实验时间。为了进一步简化实验步骤,本发明人又探索了评价含有溶出性抗菌剂样品抗菌性能的抑菌环实验,发现同一个培养皿中可以同时评价多个实验样品的抗菌性能,大量的研究结果表明,在晕圈法及琼脂培养皿扩散法中,抑菌环宽度通常在0-20毫米之间,按式I计算抑菌环宽度。
[0006]H= (D-d)/2..................(I)
式中H:抑菌环宽度,单位为(毫米);
D:抑菌圈直径,单位为(毫米); d:样品直径,单位为毫米。
[0007]因此,当样品中心点距培养皿周缘20毫米以上时,可以避免抑菌圈与培养皿周缘相交,当相邻样品中心点间相距40毫米以上时,可避免相邻样品间的抑菌圈相交。通过该实验步骤可节约大量的实验时间及成本。
[0008]在以上探索研究的基础上,本发明人发现若在加入带菌培养基之前,先在无菌培养皿中加入一层无菌的培养基,可减少由于培养皿底部不平整,引起带菌培养基厚度不一致而带来的实验误差。最终发现,这种组合方法的操作步骤十分简单,且能同时准确、快速的测定多个样品的抗菌性能,可节约大量的实验时间及成本。在以上探索研究的基础上,本发明人提出了一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法。
[0009]本发明提供的一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,该方法具体通过以下步骤实施:
⑴直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基;
⑵无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到步骤(1)所得的下层无菌培养基中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基;
⑶在培养皿反面作2-5个标记,使得每个标记点与平板周缘相距20毫米以上,相邻标记点间距离大于40毫米,用无菌镊子取直径为5毫米的圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使皮革样品的圆心位于标记点处。
[0010]⑷将步骤(3)所得的接种有试验菌的培养皿放于恒温培养箱中,倒置培养24h或48h后,通过游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径即可。
[0011]在上述方法中,带菌培养基的制备方法为:取45°C的无菌培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的试验菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀即制得带菌培养基;本方法中测试的试验菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉、粘性红圆酵母、白色念珠菌中的任意一种;本方法中的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、察氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、LB培养基中的任意一种;本方法中每个标记点与平板的周缘相聚20-30毫米,每个标记点相距40-50毫米;本方法中,将接种有细菌的培养皿放于37°C的恒温培养箱中,倒置培养24h ;接种有真菌的培养皿放于28°C的恒温培养箱中,倒置培养48h。
[0012]本发明提供的上述一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,具有以下优点:
1、本发明提供的方法,构思巧妙,实验操作非常简单,可利用传统评价皮革抗菌性能所需的仪器设备,因此本方法不需要额外的操作设备,可操作性强。
[0013]2、本发明提供的方法,用两层不同的培养基代替单层带菌培养基,可以减小由于培养皿底部不平整,引起带菌培养基厚度不一致而带来的实验误差,从而增加实验的准确性和可信度。
[0014]3、本发明提供的方法,将菌悬液直接加入无菌培养基里,再倒入已有下层无菌培养基的培养皿中,代替了晕圈法中将菌悬液用涂布器涂开的步骤,这样即减小了由于涂布不均匀而带来的误差,又节约了大量的实验时间,简化了实验步骤。
[0015]4、本发明提供的方法,可同时评价多个皮革样品的抗菌性能,且实验结果具有很高的可重复性及可信度。
【专利附图】

【附图说明】
[0016]附图为本发明方法所适用的一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法的不意图,其中al、a2、a3一试验样品,b一抑菌圈,c一菌落区域。
【具体实施方式】
[0017]下面给出实施例以对本发明作更详细的说明,有必要指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制,该领域的技术熟练人员根据上述本
【发明内容】
对本发明做出的一些非本质的改进和调整仍属本发明的保护范围。
[0018]实施例一
用打孔器取直径为5毫米的不含溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的大肠杆菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作5个标记,使每个标记点与平板的周缘相距20毫米,相邻标记点间距离40毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处,培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0019]实施例二
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的大肠杆菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作5个标记,使每个标记点与平板的周缘相距20毫米,相邻标记点间距离40毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0020]实施例三
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作4个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离45毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0021]实施例四
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的大肠杆菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌`培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作4个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离45毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0022]实施例五
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌察氏培养基,并使其凝结,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌察氏培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的黑曲霉菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,室温下静置10分钟后,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作4个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离45毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养48h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0023]实施例六用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌LB培养基,并使其凝结,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌LB培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的粘性红圆酵母菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,室温下静置10分钟后,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作4个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离45毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养48h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0024]实施例七
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的枯草芽孢杆菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作3个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0025]实施例八
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏 蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作3个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0026]实施例九
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌马铃薯葡萄糖琼脂培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的白色念珠菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作3个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养48h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。[0027]实施例十
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌牛肉膏蛋白胨培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的大肠杆菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作3个标记,使每个标记点与平板的周缘相距25毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养24h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0028]实施例^^一
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌孟加拉红培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌孟加拉红培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的粘性红圆酵母菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作2个标记,使每个标记点与平板的周缘相距30毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养48h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0029]实施例十二
用打孔器取直径为5毫米的含有溶出性抗菌剂的圆形皮革样品。向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌`察氏培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基。再取45°C的无菌察氏培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的青霉菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀,形成带菌培养基。用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到已形成下层无菌培养基的培养皿中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基。在培养皿的反面作2标记,使每个标记点与平板的周缘相距30毫米,相邻标记点间距离50毫米,用无菌镊子取圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使圆形皮革样品的圆心位于标记点处。培养48h后用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径。
[0030]为了考察本发明方法的适用性,发明人根据2002年中华人民共和国卫生部颁布的《消毒技术规范》抑菌环实验要求,判定了各实施例的抗菌性能,其中,当抑菌环宽度大于I毫米者,判为有抑菌作用。各实施例的实验判定结果见表1。
[0031]表1
【权利要求】
1.一种评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于该方法通过以下步骤实施: ⑴向直径为120毫米的无菌培养皿中倾注12mL无菌培养基,室温下静置10分钟后,形成下层无菌培养基; ⑵用无菌移液管移取6ml带菌培养基,加入到步骤(1)所得的下层无菌培养基中,摇晃培养皿使带菌培养基分布整个培养皿,室温下静置10分钟后,形成上层带菌培养基; ⑶在培养皿反面作2-5个标记,使得每个标记点与平板周缘相距20毫米以上,相邻标记点间距离大于40毫米,用无菌镊子取直径为5毫米的圆形皮革样品贴放于上层带菌培养基表面,使皮革样品的圆心位于标记点处; ⑷将步骤(3)所得的接种有试验菌的培养皿放于恒温培养箱中,倒置培养24h或48h后,通过游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径即可。
2.根据权利要求1所述的用于评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于,所述带菌培养基的制备方法为:取45°C的无菌培养基150mL,加入IOmL浓度为106cfu/mL的试验菌菌悬液,振荡锥形瓶使菌体分布均匀。
3.根据权利要求1或2所述的用于评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于,培养基为牛肉膏蛋白胨培养基、孟加拉红培养基、察氏培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、LB培养基中的任意一种。
4.根据权利要求1或2所述的用于评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于,试验菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、青霉、白色念珠菌、粘性红圆酵母中的任意一种。`
5.根据权利要求1所述的用于评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于,每个标记点与平板周缘相距20-30毫米,相邻标记点间相距40-50毫米。
6.根据权利要求1所述的用于评价含有溶出性抗菌剂皮革抗菌性能的改良晕圈法,其特征在于,将接种有细菌的培养皿放于37°C的恒温培养箱中,倒置培养24h ;接种有真菌的培养皿放于28 °C的恒温培养箱中,倒置培养48h。
【文档编号】C12R1/685GK103525897SQ201310467692
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】陈武勇, 唐秋月, 辜海彬, 孙婷, 张金伟, 滕博, 孔丽丽 申请人:四川大学
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