去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法
【专利摘要】本发明属于微生物【技术领域】，涉及纳米脂质体生物转化的优化方法，具体涉及纳米脂质体在微生物转化中应用的优化方法，特别是公开了采用纳米脂质体投料方式进行左旋乙基甾烯二酮的11α羟化制备去氧孕烯关键中间体的优化参数。采用本发明方法底物投料浓度为2g/L-7g/L时，可使左旋乙基甾烯二酮的11α羟化转化率高达60%-80%，显著高于游离底物投料方式下的投料浓度和转化率。
【专利说明】去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，涉及纳米脂质体生物转化的优化方法，具体涉及一种基于去氧孕烯中间体纳米脂质体的生物转化方法。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了微生物转化反应通常在常温常压下进行，相比于化学反应具有专一性强、污染少和产率高的优点，因此制药工业通常利用两者的优势配合使用，微生物转化可以为药物的化学合成提供关键中间体。尽管微生物转化具有独特的优势，但工业应用中常受到实际困难的制约，其中，底物对菌体的毒性和对反应的抑制作用是困扰疏水性化合物微生物转化的关键问题。实践显示，由于疏水性底物在水中溶解度极低，因此增加培养基中底物量并不能够提高转化率，随投料浓度的提高，转化率显下降趋势，这可能是过多的底物沉积于细胞表面而限制了反应物和产物的扩散，因此提高转化率的关键在于提高留体底物的有效反应浓度，可 以从提高底物溶解度和改善细胞通透性两个方面解决这一问题。
[0003]本发明的发明人已经进行研究关于将纳米脂质体应用于生物转化的技术，即采用卵磷脂为载体将疏水性底物制备成底物纳米脂质体，再进行微生物转化。这样既能够利用卵磷脂增加细胞膜通透性的特性，又能发挥纳米脂质体生物相容性好、提高水溶性及巨大比表面积的优势，促进底物向细胞内运输，提高生物利用度，使其进入微生物细胞内的量增加，从而提高转化体系底物投料浓度和转化率。
[0004]左旋乙基留烯二酮的Ila羟基衍生物是制备强效孕激素去氧孕烯的关键中间体。去氧孕烯是口服避孕药妈富隆的主要成分，由于妈富隆的副作用小，效果可靠，应用已越来越广泛，市场需求量也随之增加。美国专利(US2005/0234251A1)公开的去氧孕烯合成工艺采用左旋乙基甾烯二酮为起始原料，首先利用AspergiIIus ochraceous经生物转化引Alla羟基再进行一系列化学反应合成去氧孕烯。该专利以有机溶剂DMF溶解底物左旋乙基留烯二酮投料，投料浓度2g/L-6g/L时，羟化反应转化率为35%-60%。
[0005]本发明拟提供一种纳米脂质体应用于生物转化中提高生物转化产率的优化方法。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于设计将纳米脂质体应用于生物转化中提高生物转化产率的优化方法，特别是提供去氧孕烯关键中间体11 a羟化的纳米脂质体生物转化优化生产方法。
[0007]本发明经过大量实验证明，纳米脂质体应用于生物转化中纳米脂质体制备方法和储存方式、培养条件、投料浓度对转化产率具有较大的影响。本发明通过优化纳米脂质体制备方法和储存方式、培养基pH、底物投料浓度、转化时间和菌龄，建立了左旋乙基留烯二酮
11a羟化的纳米脂质体生物转化的优化条件，底物投料浓度和转化效率与游离底物投料方式相比都有明显提高。
[0008]本发明公开的优化生产左旋乙基留烯二酮Ila羟化衍生物的纳米脂质体生物转化参数为:采用薄膜分散法结合高压均质机制备底物纳米脂质体并制成冻干粉储存、培养基pH为6.5，转化时间60-70h，菌龄24h，投料浓度2g/L_7g/L，微生物菌种采用金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae) 11490 (CCTCC M2011240)。在此优化条件下，左旋乙基甾烯二酮11 α羟化衍生物转化率高达60%_80%。
[0009]更具体的，本发明的去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法，其特征在于，其包括步骤:
[0010]1、底物纳米脂质体的制备及保存
[0011]采用薄膜分散法将左旋乙基留烯二酮以卵磷脂为载体经高压均质机制成纳米脂质体；添加保护剂后真空冷冻干燥、-20°C储存备用。
[0012]2、微生物与培养
[0013]微生物菌种:Metarhiziumanisopliaell490,菌种保藏号 CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羟基；[0014]斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天；
[0015]发酵培养:将上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养24小时，得种子液；
[0016]3、生物转化
[0017]将制得的底物纳米脂质体冻干粉投入上述制备好的种子液中，相同条件下转化48-60h，取转化液分析；
[0018]4、分析方法
[0019]HPLC
[0020]流动相:A水，B乙腈
[0021]波长:215nm/254nm
[0022]流速:1.2mL/min
[0023]梯度洗脱:
[0024]0-5min A:B=70:30 保持 5min
[0025]5_15min 梯度 A:B=70:30 — A:B=40:60 保持 IOmin
[0026]15-25min A:B=40:60 保持 IOmin
[0027]样品用甲醇溶解；
[0028]TLC 及 TLC Scanner
[0029]取发酵液2mL加入2mL乙酸乙酯浸泡过夜,取5uL点样于GF254硅胶板，同时取底物和产物标准品(lmg/mL)luL点样对照，展开剂CH2Cl2 = CH3OH (20:1),CAMAG Scanner-3扫描分析。
[0030]本发明中，通过下述方法制备底物纳米脂质体及进行储存，本发明的实施例中采用薄膜分散法结合高压均质机制备左旋乙基留烯二酮纳米脂质体，比较了两种卵磷脂——蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂制备的脂质体，平均粒径相似，分别为131.6nm和148.3nm(如图1所示)，透射电镜观察形态相同，向上述制得的脂质体中加入5%蔗糖作保护液，经过真空冷冻干燥即得左旋乙基留烯二酮纳米脂质体冻干粉末，放入_20°C冰箱保存。脂质体制成冻干粉末后便于后续的投料处理，脂质体粒径大小也相对稳定。冻干粉末与普通冷冻脂质体(未冻干)复溶后的粒径分布结果如图2所示，冻干保护剂的加入能降低冻结过程中脂质体囊泡的脱水速度和皱缩程度，并防止冰晶对囊泡的机械损伤，直接冷冻储存脂质体，复溶后，粒径显著增大，有沉降现象；将两种卵磷脂制备的底物纳米脂质体冻干粉进行生物转化，转化效率一致，因此制备脂质体时优先选用价格较低的大豆卵磷脂。
[0031]本发明中，转化时间66h达到最大转化率，本发明的实施例中，投料浓度2g/L，分别在转化24h、36h、48h、54h、60h和66h取样分析不同转化时间转化率的变化。比较两种投料方式——纳米脂质体投料与游离底物投料(DMF溶解)的转化-时间曲线表明，纳米脂质体投料方式下(图3)，转化24h即有约1/3的底物被转化，36h后底物被迅速转化为产物，66h后产物转化率达到87.2%，底物几乎完全被转化；而01^投料方式下，底物转化始终比较缓慢，转化66h后产物DES2转化率仅为31.1%，进一步延长转化时间底物仍然不能被完全转化。证明将底物制成纳米脂质体后，促进底物迅速向胞内运输，在短时间内即被完全转化。
[0032]本发明中培养基pH控制在6.5明显有利于转化，本发明的实施例中，将培养基pH调至5.0、6.0、6.5、7.0及8.0，投料浓度3g/L，转化66h后，TLC扫描分析。结果表明培养基pH控制在6.5有利于转化(如图4所示);与现有技术报道的微生物羟化酶最适pH为6.5左右比较，本发明实验表明底物制成纳米脂质体后对转化体系PH影响不明显，生物相容性很好。
[0033]本发明中，进行了投料浓度对转化的影响试验，底物投料浓度是影响微生物转化经济性的一个重要因素，投料浓度提高意味着转化效率提高、生产成本下降；本发明的实施例中，在不同的投料浓度下(2-10g/L)，比较了纳米脂质体投料与游离底物投料(DMF溶解)的转化率，结果表明(如图5所示)，投料浓度在2g/L时，纳米脂质体投料方式下转化率高达80%以上，而游离底物投料方式下为40%左右；投料浓度提高到2g/L以上后，采用游离底物投料转化率会明显下降，主要是过多的不溶性底物对菌体生长和转化产生了毒性及抑制作用；而在纳米脂质体投料方式下，投料浓度提高到7g/L，转化率仍然可以维持在60%以上，说明将不溶性留体底物制备成纳米脂质体后，溶解性及生物相容性提高，另外粒径小造成比表面积大，多种因素促进底物向细胞内运输，提高生物利用度，使其进入微生物细胞内的量增加，从而提高转化体系底物投料浓度和转化率；
[0034]本发明中，进行了菌龄对转化的影响试验，微生物转化是先进行菌体的生长，而后投入留体底物进行转化，前期的生长时间决定了菌体产生的酶量和最佳酶活；本发明的实施例中，考查菌种生长时间(菌龄)对转化的影响:按菌龄24h、36h和48h投料，分析不同菌龄对转化率的影响(投料浓度3g/L)，转化66h后取样分析，结果表明菌龄对转化影响较大，24h菌龄最有利于转化，菌体生长过老过稠不利于转化(如图6所示)，可能由于过度衰老的菌丝不容易吸收底物及菌体内羟化酶活性下降。
[0035]本发明采用纳米脂质体技术促进去氧孕烯中间体微生物转化效率。本发明通过优化底物纳米脂质体制备和储存方法、培养基pH、转化时间、投料浓度和菌龄，建立了去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化条件。投料浓度和转化率与游离底物投料方式相比都有明显提高，表明纳米脂质体技术能很好的促进疏水性化合物微生物转化效率。
[0036]以下将通过具体的附图和实施例对本发明的左旋乙基留烯二酮Ilci羟化，优化纳米脂质体投料方式下的系统参数进行详细地描述。【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1蛋黄卵磷脂与大豆卵磷脂制备的底物纳米脂质体粒径比较。A，蛋黄卵磷脂制备的底物纳米脂质体粒径；B，大豆卵磷脂制备的底物纳米脂质体粒径。
[0038]图2底物纳米脂质体冻干粉与直接冷冻保藏脂质体复溶后粒径比较。A,底物纳米脂质体冻干粉复溶后粒径分布；B，直接冷冻保藏的底物纳米脂质体复溶后粒径分布。
[0039]图3纳米脂质体投料与游离底物投料(DMF溶解)的转化-时间曲线。
[0040]图4培养基pH对转化的影响。
[0041]图5转化率随投料浓度的变化。
[0042]图6菌龄对转化率的影响。【具体实施方式】
[0043]实施例1:底物纳米脂质体的制备及储存优化
[0044]将卵磷脂与左旋乙基留烯二酮，按照5:1 (质量比)的比例溶于适量无水乙醇中，使其全部溶解。转移至IL圆底烧瓶中，30°C恒温水浴中，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜。用IOOmL PBS (pH=7.4)水化类脂薄膜(30°C )，形成粗悬液。将脂质体悬液在600bar压力下，用高压均质机处理五次，即得左旋乙基留烯二酮纳米脂质体。比较了两种卵磷脂——蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂制备的脂质体，平均粒径相似，分别为131.6nm和148.3nm (图1)，透射电镜观察形态相同。向上述制得的脂质体中加入5%蔗糖作保护液，放入_70°C冰箱冷冻48h。取出冷冻后的脂质体，转移至冷冻干燥机蒸发48h，即得左旋乙基留烯二酮纳米脂质体冻干粉末，放入-20°C冰箱保存。脂质体制成冻干粉末后便于后续的投料处理，脂质体粒径大小也相对稳定。冻干粉末与普通冷冻脂质体(未冻干)复溶后的粒径分布结果见(图2)。冻干保护剂的加入可降低冻结过程中脂质体囊泡的脱水速度和皱缩程度，并防止冰晶对囊泡的机械损伤。直接冷冻储存脂质体，复溶后，粒径显著增大，有沉降现象。将两种卵磷脂制备的底物纳米脂质体冻干粉进行生物转化，转化效率一致，因此制备脂质体时可以优先选用价格较低的大豆卵磷脂。
[0045]实施例2转化时间的优化
[0046]1、底物纳米脂质体冻干粉的制备
[0047]按实施例1所述方法制备底物纳米脂质体冻干粉备用
[0048]2、微生物与培养
[0049]微生物菌种:Metarhiziumanisopliaell490,菌种保藏号 CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羟基。
[0050]斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天。
[0051]发酵培养:将上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养24小时，得种子液。
[0052]3、生物转化
[0053]将制备好的底物纳米脂质体冻干粉按2g/L的底物浓度投入上述制备好的种子液中(50mL摇瓶装液量10mL)，分别在转化24h、36h、48h、54h、60h和66h取样分析不同转化时间转化率的变化。比较两种投料方式——纳米脂质体投料与游离底物投料(DMF溶解)的转化-时间曲线表明，纳米脂质体投料方式下(图3)，转化24h即有约1/3的底物被转化，36h后底物被迅速转化为产物，66h后产物产量达到17.44mg (转化率87.2%)，底物几乎完全被转化；而DMF投料方式下，底物转化始终比较缓慢，转化66h后产物DES2产量仅为6.22mg(转化率31.1%)，进一步延长转化时间底物仍然不能被完全转化。证明将底物制成纳米脂质体后，促进底物迅速向胞内运输，在短时间内即被完全转化。
[0054]实施例3转化pH的优化
[0055]1、底物纳米脂质体冻干粉的制备
[0056]按实施例1所述方法制备底物纳米脂质体冻干粉备用。
[0057]2、微生物与培养
[0058]微生物菌种:Metarhiziumanisopliaell490,菌种保藏号 CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羟基。
[0059]斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天。
[0060]发酵培养:将上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养24小时， 得种子液。
[0061]3、生物转化
[0062]将培养基pH调至5.0,6.0,6.5,7.0及8.0，投料浓度3g/L，转化66h后,TLC扫描分析。结果表明培养基pH控制在6.5有利于转化(如图4所示)
[0063]实施例4投料浓度的优化
[0064]1、底物纳米脂质体冻干粉的制备
[0065]按实施例1所述方法制备底物纳米脂质体冻干粉备用。
[0066]2、微生物与培养
[0067]微生物菌种:Metarhiziumanisopliaell490,菌种保藏号 CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羟基。
[0068]斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天。
[0069]发酵培养:将上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min培养24小时，得种子液。
[0070]2、生物转化
[0071]在不同的投料浓度下(2-10g/L)，比较了纳米脂质体投料与游离底物投料(DMF溶解)的转化率，结果表明(如图5所示)，投料浓度在2g/L时，纳米脂质体投料方式下转化率高达80%以上，而游离底物投料方式下为40%左右；投料浓度提高到2g/L以上后，采用游离底物投料转化率会明显下降，主要是过多的不溶性底物对菌体生长和转化产生了毒性及抑制作用；而在纳米脂质体投料方式下，投料浓度提高到7g/L，转化率仍然可以维持在60%以上。[0072]实施例5菌龄的优化
[0073]1、底物纳米脂质体冻干粉的制备
[0074]按实施例1所述方法制备底物纳米脂质体冻干粉备用。
[0075]2、微生物与培养
[0076]微生物菌种:Metarhiziumanisopliaell490,菌种保藏号 CCTCC M2011240。该菌种能在左旋乙基留烯二酮上引入Ila羟基。
[0077]斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天。
[0078]发酵培养:将 上述斜面菌种在无菌条件下用接种环接I环于装有40mL液体培养基(10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28 °C条件下，旋转式摇床220r/min分别培养24h、36h和48h，得不同菌龄的种子液。
[0079]3、生物转化
[0080]将底物纳米脂质体冻干粉分别投入菌龄24h、36h和48h的种子液中，分析不同菌龄对转化率的影响(投料浓度3g/L)，转化66h后取样分析，结果表明菌龄对转化影响较大，24h菌龄最有利于转化，菌体生长过老过稠不利于转化(如图6所示)。
【权利要求】
1.去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法，包括以左旋乙基留烯二酮为原料，以金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490 (CCTCC M2011240)为菌种进行微生物转化，其特征在于，该方法采用卵磷脂为载体将疏水性底物左旋乙基留烯二酮制成底物纳米脂质体，再进行微生物转化，其包括步骤: 1)底物纳米脂质体的制备 采用薄膜分散法将左旋乙基留烯二酮以卵磷脂为载体经高压均质机制成纳米脂质体，测定平均粒径； 2)微生物与培养 微生物菌种:Metarhizium anisopliaell490,菌种保藏号CCTCC M2011240 ;该菌种在左旋乙基留烯二酮上引入11 α羟基； 斜面培养:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25%的蚕蛹粉，26~30°C培养5~10天； 发酵培养:将上述斜面菌种无菌接种于装有液体培养基摇瓶中，28°C条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时，得种子液； 3)生物转化 将制得的底物纳米脂质体按底物浓度投入上述制备好的种子液中，相同条件下转化，取转化液分析； 4)分析方法 取发酵液加入L乙酸乙酯浸泡过夜,取样点样于GF254硅胶板，同时取底物和产物标准品点样对照，展开剂CH2Cl2 = CH3OH (20:1), CAMAG Scanner-3扫描分析； 所述的方法中将纳米脂质体应用于去氧孕烯关键中间体Ila羟化的优化条件为:采用薄膜分散法结合高压均质机制备底物纳米脂质体并制成冻干粉储存，培养基PH为6.5，转化时间60-70h，菌龄24h，投料浓度2g/L-7g/L。
2.按权利要求1所述的去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法，其特征在于，所述的卵磷脂选自蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂。
3.按权利要求1所述的去氧孕烯中间体纳米脂质体生物转化的优化方法，其特征在于，所述的液体培养基中含有10g/L葡萄糖、10g/L黄豆粉、5g/L蚕蛹粉，pH6.5。
【文档编号】C12R1/645GK103834712SQ201310484977
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2012年11月26日
【发明者】冯美卿, 叶丽 申请人:复旦大学