一种荧光rt-pcr检测异育银鲫tlr9基因相对表达量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的方法。通过异育银鲫TLR9基因特异性上、下游引物：TLR9－qF:5’–TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT–3’;TLR9－qR:5’–CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG–3’，获得异育银鲫TLR9基因的140bp产物。TLR9基因的表达丰度在一定程度上反映了异育银鲫免疫系统的活度，可以作为异育银鲫疾病防治中的免疫监测指标。通过检测异育银鲫TLR9基因表达量的变化，可以提早判断异育银鲫是否感染了病原，及时采取有效的预防治疗措施，避免疾病的严重发展造成不可挽回的巨大损失。
【专利说明】—种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的方法【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及用于检测异育银鲫TLR9基因表达的特异性引物， 更具体地说是涉及一种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的方法。主要用于异育银鲫TLR9基因表达调控机理研究和免疫学功能研究，以及异育银鲫早期病原感染的监测。【背景技术】[0002]随着世界水产养殖业的快速发展，水产养殖产量大幅增加，水产品的跨国贸易及水产苗种的跨区域交流也日益频繁，极大增加了水产动物病原微生物的传播几率。此外，水产养殖的高密度集约化、渔业水环境的恶化以及各种抗菌抗生素类渔药的滥用，也会引发水产养殖动物的应激反应，导致机体的免疫系统受到抑制。正是这些因素的相互影响，导致鱼病频发，给渔业发展造成了不可估量的损失。运用现代生物技术作为水产养殖的技术支撑，掌握疾病的免疫防御技术是渔业健康可持续发展所必须解决的问题。在对疾病防治途径进行探索的过程中，人们逐渐认识到免疫防病技术的优越性，近年来国际上鱼类免疫学的研究逐渐受到重视。[0003]1996年，Science杂志发表了题为“天然免疫对获得性免疫应答的指导作用” 一文，首次明确地将天然免疫提高到如此重要的地位。1997年Current Opinion In Immunology刊文提出模式识别受体(pattern-recognizing receptors, PRRs)和病原相关的分子模式(pathog en-associated molecular patterns, PAMPs)的概念，论证 PRRs 的模式识别作用赋予免疫系统识别“自己” “非己”的能力，标志着天然免疫研究进入了一个崭新的阶段。鱼类是获得性免疫(特异性免疫)和天然免疫(非特异性免疫)并存的脊椎动物， 但与哺乳动物相比，鱼类获得性免疫机制还不完善，在抵御病原微生物时主要依赖天然免疫发挥作用。[0004]Toll样受体(Tol 1-1 ike receptors,TLRs)家族是动物识别入侵病原体的主要“模式识别受体”(PRRs)，几乎可以识别所有病原微生物的高度保守的结构基序“病原相关的分子模式”(PAMPs)，在启动机体产生天然免疫应答上起着非常关键的作用。PAMPs包括各种细菌细胞壁成分，如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，以及病毒的RNA，酵母细胞壁上的甘露糖， 还有鞭毛蛋白、细菌DNA等。在人类中已经证明具有病毒识别功能的有TLR2、TLR3、TLR4、 TLR7、TLR8和TLR9。与在人类等高等哺乳动物研究相比，TLRs在鱼类及其他低等脊椎动物中的研究还比较少，但通常认为TLR1、2、4、5和6主要参与细菌成分的识别，而TLR3、7和8 主要特异性地识别病毒性成分，TLR9对这二者均能够识别。[0005]异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是利用三倍体的方正银鲫为母本、二倍体的兴国红鲤为父本，通过人工杂交的方法诱使方正银鲫的卵进行雌核发育而培育的鲫鱼养殖新品种，由于其具有生长速度快、适应范围广、肉味鲜美等特点，已成为国内大力推广养殖的优良品种之一。近年来，由于水环境的恶化、养殖规模的扩大、渔药使用的不规范等因素，异育银鲫病害发生率不断攀升，尤其是2011年8月在我国异育银鲫主要养殖区江苏省出现重大疫情“鲫鱼病毒性出血病，”短时间内疫病迅速蔓延，发病面积超过10万亩，死亡率高达90-100%，造成经济损失达数亿元。本研究室国家大宗淡水鱼类病毒学类岗位科学家曾令兵研究员带领团队成员第一时间迅速介入，通过病原分离、电镜观察、回归感染以及PCR扩增等技术确定异育银鲫病毒性出血病的病原为“鲤疱疹病毒II型”(Cyrinidherpesvirus-2, Cy HV_2)。由于异育银鲫的病毒性出血病在国内是首次发现，缺乏相关的前期研究基础，而且对于异育银鲫的免疫机理和机制了解较少，所以目前对于该病毒病尚无有效的免疫防治技术和治疗方法。
[0006]TLRs是宿主免疫的必需分子，通过感知入侵的病原微生物，识别病原相关分子模式，活化细胞内信号，来激活宿主的天然免疫系统产生免疫应答，进而抵御病原微生物的感染。TLR9作为TLRs家族的重要成员，参加鱼类的免疫调节，在一定程度上反映了鱼类的免疫能力，因此可以作为鱼类疾病防治中免疫监测的指标。有关异育银鲫TLR9基因的研究尚未见报道，本研究室利用RACE技术首次从异育银鲫中克隆得到了 TLR9基因的全长cDNA序列，其Genbank序列号为KC816577。
[0007]实时突光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)是在常规 PCR 技术的基础上发展起来的核酸定量技术。与常规PCR相比，实时荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，保证了结果的可靠性和可重复性，已广泛应用于分子生物学和医学等研究领域。随着实时荧光定量PCR检测试剂盒的进一步研发，实时荧光定量PCR技术在水产动物疫病诊断中也得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供了一种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的方法。与常规PCR相比，该方法具有灵敏度高、特异性强、时间短、重复性好优点。
`[0009]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0010]一种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的方法，步骤如下:
[0011](I)针对异育银鲫TLR9基因设计的引物序列如下:
[0012]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’
[0013]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’
[0014]根据鲫鱼β-actin基因cDNA序列(JX413519)，设计一对适用于实时荧光定量PCR检测的内参基因特异性引物，引物序列如下:
[0015]β -actin-qF: 5 ’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3’
[0016]β -actin-qR: 5 ’ - AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3 ’ ；
[0017](2)总RNA的提取与纯化:采用常规RNA提取和纯化方法，从异育银鲫脾脏中提取得到纯化的总RNA ；
[0018](3) cDNA第一链的合成:以异育银鲫脾脏总RNA为模板合成cDNA第一链；
[0019](4)实时荧光定量 PCR:采用 Bioteke 的 Power2XSYBR Real-time PCRPremixture试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述(I)中TLR9-qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR为引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，PCR扩增结束后所得3个平行管的Ct值取平均数。
[0020]实时荧光定量PCR扩增体系如下:
[0021]Power2 X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、20 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一链模板2 μ L、无菌双蒸水21 μ I,总反应体积为50 μ L。
[0022]实时突光定量PCR反应参数设置如下:
[0023]95 °C 2min ；
[0024]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 个循环)。
[0025](5)异育银鲫脾脏组织中TLR9基因相对表达量的计算:实时荧光定量PCR完成后，根据获得的Ct值计算异育银鲫被病毒感染后各时间段下的ACt和T (Λ Λ⑴值，计算方法如下:
[0026]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0027]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 时健康异育银鲫)
[0028]以2_ (Λ "Gt)数值表示异育银鲫脾脏中TLR9基因相对于健康异育银鲫TLR9基因的
表达量。
[0029]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0030](I)本发明采用的实时`荧光定量PCR技术与常规PCR相比，实时荧光定量PCR技术自动收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可提高实验的灵敏度；实时荧光定量PCR技术采用全封闭反应，无需PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性；实时荧光定量PCR技术也免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
[0031](2) TLR9基因的表达丰度在一定程度上反映了异育银鲫免疫系统的活度，当TLR9基因相对表达量增高时，提示异育银鲫可能已处于病原感染状态，而此时凭肉眼还观察不到异育银鲫体表上有任何病原感染病症。因此通过监测异育银鲫脾脏组织中TLR9基因相对表达量的变化，可提早得知异育银鲫是否被病原感染，及时采取有效的预防治疗措施，避免势态的严重发展造成不可挽回的损失。
[0032](3)TLRs是宿主免疫的必需分子，通过感知入侵的病原微生物，识别病原相关分子模式，活化细胞内信号，来激活宿主的天然免疫系统产生免疫应答，进而抵御病原微生物的感染。TLR9作为TLRs家族的成员，参加鱼类的免疫调节，TLR9可识别病毒成分，病毒感染宿主后，TLR9的表达量显著升高。因此可以通过TLR9基因对病毒进行监测，一旦发现表达量升高，立即采取预防措施，赢取时间并做进一步详细诊断和治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为异育银鲫TLR9基因和内参基因β-actin实时荧光定量PCR产物电泳结果;
[0034]从左至右的泳道依次为DL500DNA Marker,TLR9 基因(140bp)、β -actin (198bp)、DL500DNA Marker。
[0035]图2为TLR9基因在健康异育银鲫及腹腔注射CyHV_2病毒的异育银鲫脾脏组织中的差异表达分析。【具体实施方式】[0036]下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。[0037]实施例1:[0038]异育银鲫的人工感染实验:[0039]收集病鱼(鲤疱疹病毒II型感染)的肝、脾、肾等内脏组织于无菌培养皿中，用无菌眼科剪剪碎，加入10倍体积(V/W)的DPBS(Sigma公司产品)，转入玻璃均化器内并在冰浴下研磨成组织匀浆液。将组织匀浆液转移至50mL离心管中(BD公司产品)，在280°C冷冻后于室温再融化，如此反复冻融3次，随后在4°C，4000r/min离心30min (Sigma, 3K215)。取上清液经0.22 μ m滤器(Nalgene公司产品)过滤。获得的组织匀浆滤液(病毒的copy数为l.eXlOYopies/yL)立即用于鱼体人工感染试验，剩余滤液可分装于冻存管(Corning 公司产品)并在_80°C保存备用。[0040]人工感染试验在水族箱中进行，水体体积为40L，连续充气，水温25°C。取近期未用过疫苗的健康异育银鲫(体长10~15cm) 60尾，每尾经腹腔注射0.2mL上病毒悬液，作为病毒感染组；以DPBS注射作为对照组，继续在水族箱中培养，分别于注射病毒后的6h、12h、 24h、48h、72h取其脾脏组织，迅速置于液氮中冻存保藏。[0041]实施例2:[0042]总RNA的提取和纯化:[0043](I)取液氮冻存的脾脏组织50-100mg加入ImL Trizol后，用匀浆器彻底匀浆混匀，室温放置5min，使其充分裂解。[0044](2)4°C, 12, 000r/min,离心IOmin,上清转移至一新的无RNase的1.5mL离心管中，弃沉淀。[0045](3)每管加入200 μ L氯仿，振荡混匀后室温放置15min。[0046](4)4°C, 12, 000r/min,离心15min,吸取上层水相,转移至一新的无RNase的1.5mL 离心管中。[0047](5)每管加入0.5mL异丙醇,轻轻混匀后,室温放置5_10min。[0048](6) 4°C, 12，000r/min,离心 IOmin,弃上清,RNA 沉于管底。每管加入 ImL DEPC 水配制的75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。[0049](7) 4°C,8, 000r/min,离心5min,尽量弃上清,所得沉淀即为异育银鲫脾脏组织的 RNA,室温晾干5-10min后，加入DEPC水溶解，并于_80°C保存备用。[0050]实施例3:[0051]TLR9基因的实时荧光定量PCR检测:[0052](I)引物: [0053]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’[0054]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’[0055]异育银鲫TLR9基因的PCR产物预计长度为140bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR 扩增后的产物长度与预计长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性， 适合用于实时荧光定量PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。[0056]同时根据Genbank里查找到的鲫鱼β-actin基因cDNA序列(JX413519)，设计一对适用于实时荧光定量PCR检测的内参基因特异性引物，引物序列如下:[0057]β-actin-qF:5’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3，
[0058]β -actin-qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3，；
[0059]异育银鲫β -actin基因的PCR产物预计长度为198bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增后的产物长度与预计长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
[0060](2) cDNA第一链的合成:
[0061]以实施例2所得到的异育银鲫脾脏总RNA作为模板，用ImProm-1I TM反转录试剂盒(Promega)中的01 igo(dT)作为引物,按照试剂盒说明书进行反转录,合成cDNA第一链，反应体系的总体积为20 μ L。
[0062](3)实时荧光定量PCR:
[0063]实时突光定量PCR 米用 Bioteke 的 Power2X SYBR Real-time PCR Premixture试剂盒进行。以上述(2)中合成的cDNA第一链为模板，上述(I)中TLR9_qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR为引物，进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，PCR扩增结束后所得3个平行管的Ct值取其平均数。
[0064]实时荧光定量PCR扩增体系如下:
[0065]Power2X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、10 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一链模板2 μ L、无菌双蒸水21 μ I,总反应体积为50 μ L。
[0066]实时突光定量PCR反应参数设置如下:
[0067]95 °C 2min ；`
[0068]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 个循环)。
[0069](4)病毒感染的异育银鲫脾脏中TLR9基因相对表达量的计算:
[0070]实时荧光定量PCR完成后，根据所获得的Ct值计算异育银鲫被病毒感染后各时间段下的Λ Ct和2_(ΛΛΜ)值，计算方法如下:
[0071]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0072]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 时健康异育银鲫)
[0073]以2_(Δ "Gt)数值表示病毒感染异育银鲫脾脏中TLR9基因相对于健康异育银鲫TLR9基因的表达量。
[0074]2_(Λ 数值代表了病毒感染异育银鲫脾脏中TLR9基因相对于健康异育银鲫TLR9基因的表达倍数。β-actin即β_肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，在所有类型的细胞中都进行表达，且其表达水平仅受启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，受环境影响因素很小，表达水平较为恒定，因此β-actin被作为公认的内参基因，常用做测定目标基因表达量时的内参照。本实验中2_(ΔΔΜ)数值越大，表明TLR9基因的表达量越高。
[0075]图2为病毒感染后的不同时间段异育银鲫脾脏组织中TLR9基因的相对表达量。从图中可以看出，病毒感染后的12h，TLR9基因的表达量就开始升高，表达量是健康异育银鲫(Oh)的10.1倍；感染后的24h，TLR9表达量是健康异育银鲫的51.3倍；72h时TLR9表达量达到最高，是健康异育银鲫的75.7倍。以上结果表明，当TLR9基因相对表达量增高时，即表明异育银鲫已经处于病原感染状态，异育银鲫体内固有的免疫系统已经启动，尽管此时从肉眼上观察不到异育银鲫体表上有任何感染的病症。
[0076]表1为在不同时间段测得的TLR9基因的Ct值
【权利要求】
1.一种荧光RT-PCR检测异育银鲫TLR9基因相对表达量的特异性引物，其特征在于它是由符合荧光定量PCR反应特点的异育银鲫TLR9基因特异性上、下游引物:TLR9 — qF: 5’ -TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’；TLR9 —qR: 5’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’ ； 以及作为内参基因的异育银鲫β -actin基因特异性上、下游引物:β — actin — qF:5’ -CACCACGGCCGAAAGAGAA`ATT - 3，； β — actin — qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3， 组成。
【文档编号】C12Q1/68GK103498003SQ201310502471
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月23日 优先权日:2013年10月23日
【发明者】范玉顶, 曾令兵, 周勇, 董圣, 徐进, 张辉 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所