一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法
【专利摘要】一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，属于微生物农药生产【技术领域】。其包括以下工艺步骤：1）幼虫大量饲养；2）病毒增殖；3）病毒收集；4）病毒提取。本发明具有以下有益效果，一是防止茶毛虫毒毛引起的皮肤过敏，本发明采用通风橱中更换饲料及收集虫尸，大大降低了沾染茶毛虫毒毛的几率，有效防止过敏；二是提高病毒产量，本发明采用盆栽茶树产越冬卵，显著提高了越冬卵的孵化率，孵化率从10-15%提高到65-80%，确保了来年第1代幼虫饲养量和病毒生产量，同时本发明采用病毒干尸收集法，降低了病毒在收集中的损失，比常规收集法效率提高52.7%，病毒产量提高38.8%。
【专利说明】—种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物农药生产【技术领域】，具体涉及一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法。
【背景技术】
[0002]茶毛虫(Aoprocii1S /zsewt/ocimspersa)是我国茶园主要食叶害虫,它不仅影响茶叶产量，还因虫体上的毒毛极易引起人体皮肤过敏，严重影响茶园田间管理。茶毛虫核型多角体病毒 pseudoconspersa nucleopolyhedrovirus,简称 EpNPV)是茶毛虫的天敌优势种，具有对茶毛虫杀虫效果好、对茶园天敌和环境安全等优点。茶毛虫核型多角体病毒的生产采用的是活虫增殖法，其生产工艺为:首先大量饲养健康幼虫，在达到一定虫龄时饲喂一定浓度的病毒，这时每一头虫都成为一个病毒增殖个体，待病毒在虫体中增殖到一定时间后，收集死虫，提取出病毒。目前，在茶毛虫病毒生产中存在两个主要问题。一是操作人员极易发生过敏 。茶毛虫属毒蛾科，其幼虫、蜕、蛹茧均带有毒毛，极易引起人皮肤过敏。即使沾染一点毒毛，即会痛痒难耐，引发皮炎。茶毛虫幼虫龄期多，历期长，一般有7-8龄，幼虫期长达40-45天，一个病毒生产周期更是长达近2个月，因此病毒生产过程中，操作人员极易沾染茶毛虫的毒毛或蜕皮壳而导致严重的皮肤过敏。二是病毒产量不高。茶毛虫年发生代数少，一般一年只有2-3代，因此每一代幼虫的饲养量均极大地影响着病毒总产量。目前在室内连续大量饲养过程中，采用将成虫接入养虫笼中瓶插水培茶枝叶片上产卵。由于茶毛虫卵块越冬时间长达4-5个月，水培茶枝的叶片常掉落枯萎，造成越冬卵大量死亡，卵的孵化率低于15%，影响第I代幼虫的饲养量。同时，在病毒生产收集死虫的过程中，由于病毒虫尸易破碎，收集时损失较多，病毒单产较低，从而影响病毒产量。因此，寻找一种能够减少操作人员过敏并能提高病毒产量的生产工艺是目前亟需解决的技术问题。
【发明内容】
[0003]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法的技术方案，该方法能减少操作人员过敏，提高病毒产量。
[0004]所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
1)幼虫大量饲养
越冬代茶毛虫采用盆栽茶树在自然温度下产卵，其他代的茶毛虫则采用水培茶枝上产卵，待卵块孵化后，幼虫用茶鲜叶进行饲养，饲养容器根据虫龄增长更换更大的容器，饲养容器上部覆盖保湿物保持湿度，饲料更换或添加均在通风橱中进行；
2)病毒增殖
待幼虫生长至6龄中期时，饲喂含0.005亿多角体(PIB) /毫升浓度病毒的茶叶，饲毒2-3天后再改用无毒茶叶饲养，感染幼虫在体内逐步繁殖病毒；
3)病毒收集
6龄中期幼虫饲毒10天后，揭去饲养容器上的保湿物，降低湿度，使虫尸自然阴干，待所有幼虫死亡并阴干后，在通风橱中将干尸一次性收集在容器内；
4)病毒提取
将收集得到的虫尸经浸泡、研碎、过滤、离心沉淀，显微镜测数，定量稀释成病毒原液后，低温冷减。
[0005]所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)和2)中饲养条件为恒温23.5±0.5°C,自然光照。
[0006]所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)中待卵块孵化后，将带虫叶片剪下，放入罐头瓶中，每瓶一个卵块，加入老茶叶饲养，并用纸扎口，盖保湿物玻璃片保湿，瓶内叶片大部分食去时，在通风橱中及时去除残片、加入新叶；待幼虫生长到4龄时，在通风橱中将瓶内幼虫移至木盒中，每盒1000-1500头虫，并加入带老叶的茶枝饲养，盒上盖保湿物湿毛巾和玻璃保湿。
[0007]所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤4)中虫尸用无菌水浸泡1-2天后，用组织捣碎机捣碎，过滤后将滤液用离心机3000-4000r/min离心30min，去上清液，病毒多角体沉淀搅匀后加水再离心I次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，定量稀释至一定浓度获得病毒原液，低温冷藏。
[0008]本发明与现有技术相比，具有以下有益效果，一是防止茶毛虫毒毛引起的皮肤过敏，本发明采用通风橱中更换饲料及收集虫尸，大大降低了沾染茶毛虫毒毛的几率，有效防止过敏；二是提高病毒产量， 本发明采用盆栽茶树产越冬卵，显著提高了越冬卵的孵化率，孵化率从10-15%提高到65-80%，确保了来年第I代幼虫饲养量和病毒生产量，同时本发明采用病毒干尸收集法，降低了病毒在收集中的损失，比常规收集法效率提高52.7%，病毒产量提闻38.8%。
【具体实施方式】
[0009]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0010]实施例1:
将盆栽茶树放入养虫笼(长55cmX宽55cmX高90cm，塑料纱网)中，接入茶毛虫成虫100-150对，任其在笼内交配，在叶背产卵。将养虫笼放置于室外或室内自然温度下越冬。
[0011]待卵块孵化后，将带虫叶片剪下，放入罐头瓶中。每瓶一个卵块，加入数片老叶饲养，并用纸扎口，盖玻璃片保湿。瓶内叶片大多食去时，及时去除残片、加入新叶。待幼虫生长到4龄时将瓶内幼虫移至木盒中，每盒约1000-1500头虫，加入带老叶的茶枝饲养，盒上盖湿毛巾和玻璃保湿。
[0012]待幼虫生长到6龄中期时，进行饲毒处理。方法为:先剪取带老叶的新鲜茶枝，然后配制0.005亿多角体(PIB) /毫升浓度的EpNPV病毒液，将茶枝在病毒液中浸湿后，成束插在500mL盛水的广口瓶中，待茶枝阴干后，将带有病毒的枝叶添加至养虫盒中。饲毒2-3天后，改用不带病毒的新鲜茶枝饲喂。约10天后，幼虫不再取食。待幼虫开始死亡后，揭去饲养容器上的保湿物，降低湿度，使虫尸阴干，待幼虫全部死亡并阴干后，将干尸一次性收集在容器内。
[0013]从卵孵化开始，饲养温度均控制在恒温23.5±0.5°C左右，自然光照。上述病毒生产过程中更换饲料及收集虫尸均在通风橱中进行。[0014]虫尸用无菌水浸泡1-2天后，用组织捣碎机捣碎，过滤后将滤液用离心机3000-4000r/min离心30min，去上清液，病毒多角体沉淀搅匀后加水再离心I次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，获得病毒原液。采用血球计数板计数法测定病毒多角体的数量，计算病毒产量。
[0015]实施例2:
在成虫开始羽化后，将装有茶毛虫蛹的罐头瓶放入养虫笼(30cmX46cmX 55cm，塑料纱网)内，打开瓶口纸盖，每笼3瓶，同时在笼中放置两束水培的茶枝，任成虫交尾、产卵。
[0016]待卵块孵化后，将带虫叶片剪下，放入罐头瓶中。每瓶一个卵块，加入数片老叶饲养，并用纸扎口，盖玻璃片保湿。瓶内叶片大多食去时，及时去除残片、加入新叶。待幼虫生长到4龄时将瓶内幼虫移至木盒中，每盒约1000-1500头虫，加入带老叶的茶枝饲养，盒上盖湿毛巾和玻璃保湿。
[0017]待幼虫生长到6龄中期时，进行饲毒处理。方法为:先剪取带老叶的新鲜茶枝，然后配制0.005亿多角体(PIB) /毫升浓度的EpNPV病毒液，将茶枝在病毒液中浸湿后，成束插在500mL盛水的广口瓶中，待茶枝阴干后，将带有病毒的枝叶添加至养虫盒中。饲毒2-3天后，改用不带病毒的新鲜茶枝饲喂。约10天后，幼虫不再取食。待幼虫开始死亡后，揭去饲养容器上的保湿物，降低湿度，使虫尸阴干，待幼虫全部死亡并阴干后，将干尸一次性收集在容器内。
[0018]从卵孵化开始，饲养温度均控制在恒温23.5±0.5°C左右，自然光照。上述病毒生产过程中更换饲料及收集虫尸均在通风橱中进行。
[0019]虫尸用无菌水 浸泡1-2天后，用组织捣碎机捣碎，过滤后将滤液用离心机3000-4000r/min离心30min，去上清液，病毒多角体沉淀搅匀后加水再离心I次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，获得病毒原液。采用血球计数板计数法测定多角体的数量，计算病毒产量。
[0020]上述茶毛虫核型多角体病毒生产工艺，同传统生产工艺相比，具有两大优点:(I)防止皮肤过敏。茶毛虫幼虫龄期多，历期长，一般有7-8龄，幼虫期长达40-45天，病毒生产周期更是长达近2个月，过敏的几率极高。在病毒生产过程中最易引起过敏的环节为更换饲料和收集虫尸。本发明采用通风橱中更换饲料及收集虫尸，大大降低了毒毛沾染到皮肤的几率，从而防止操作人员皮肤过敏。(2)提高病毒产量。一方面，本方法采用盆栽茶树产卵越冬，显著提高了茶毛虫越冬卵孵化率。传统方法中卵产在离体叶片上，由于越冬期长达3-4个月，叶片在卵孵化之前即枯萎干瘪，卵块的越冬孵化率很低。采用盆栽茶树产卵越冬，孵化率从10-15%提高到65-80%，确保了茶毛虫人工连续饲养，提高了第I代幼虫饲养量，从而提高病毒产量。另一方面，本方法采用病毒干尸收集法，比常规收集方法(逐日收集死虫)效率提高52.7%，病毒产量提高38.8% ;同一次性收集活虫的方法相比，病毒产量提高31.8% (表 I)。
[0021]表1茶毛虫病毒不同收集方法的比较
【权利要求】
1.一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于包括以下工艺步骤: 1)幼虫大量饲养 越冬代茶毛虫采用盆栽茶树在自然温度下产卵，其他代的茶毛虫则采用水培茶枝在恒温条件下产卵，待卵块孵化后，幼虫用茶鲜叶进行饲养，饲养容器根据虫龄增长更换更大的容器，饲养容器上部覆盖保湿物保持湿度，饲料更换或添加均在通风橱中进行； 2)病毒增殖 待幼虫生长至6龄中期时，饲喂含0.005亿多角体(PIB) /毫升浓度病毒的茶叶，饲毒2-3天后再改用无毒茶叶饲养，感染幼虫在体内逐步繁殖病毒； 3)病毒收集 6龄中期幼虫饲毒10天后，揭去饲养容器上的保湿物，降低湿度，使虫尸自然阴干，待所有幼虫死亡并阴干后，在通风橱中将干尸一次性收集在容器内； 4)病毒提取 将收集得到的虫尸经浸泡、研碎、过滤、离心沉淀，显微镜测数，定量稀释成病毒原液后，低温冷减。
2.如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)和2)中饲养条件为恒温23.5±0.5°C，自然光照。
3.如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤I)中待卵块孵化后，将带虫叶片剪下，放入罐头瓶中，每瓶一个卵块，加入老茶叶饲养，并用纸扎口，盖保湿物玻璃片保湿，瓶内叶片大部分食去时，在通风橱中及时去除残片、加入新叶；待幼虫生长到4龄时，在通风橱中将瓶内幼虫移至木盒中，每盒1000-1500头虫，并加入带老叶的茶枝饲养，盒上盖保湿物`湿毛巾和玻璃保湿。
4.如权利要求1所述的一种茶毛虫核型多角体病毒的生产方法，其特征在于所述的步骤4)中虫尸用无菌水浸泡1-2天后，用组织捣碎机捣碎，过滤后将滤液用离心机3000-4000r/min离心30min，去上清液，病毒多角体沉淀搅匀后加水再离心I次，最后用蒸馏水洗出多角体沉淀，定量稀释至一定浓度后获得病毒原液。
【文档编号】C12R1/93GK103589691SQ201310514943
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】唐美君, 殷坤山, 郭华伟, 肖强 申请人:中国农业科学院茶叶研究所