一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法
【专利摘要】本发明公开了一种卵巢颗粒细胞分离提纯的方法。具体步骤为：首先将细胞沉淀物上层的白色黏液团收集至另一离心管,PBS洗涤1次后加入等体积的300IU/ml透明质酸酶,吹打混匀,室温消化1~2min,再用2倍体积含FBS的DMEM/F12培养液终止消化；余下细胞沉淀物加入3倍体积的红细胞裂解液,颠倒混匀,冰上静置。本发明的有益效果是，对颗粒细胞存活率无明显影响，更为省时高效,有助于建立稳定的颗粒细胞体外培养体系。
【专利说明】一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种分离提纯的方法，具体来说，是指一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法。
【背景技术】
[0002]颗粒细胞是卵泡内最大的细胞群，与卵泡膜细胞协同调控女性甾体激素的合成，也直接参与了卵母细胞的生长、发育和成熟等生殖事件。因此，颗粒细胞可作为研究女性生殖细胞生物学行为及其功能调控的良好细胞模型。当今人工辅助生殖技术得到广泛应用，操作过程废弃的卵泡液中含有大量的颗粒细胞，收集这类颗粒细胞行体外培养实验，可为了解颗粒细胞的某些细胞活动提供参考资料。文献报道的颗粒细胞体外分离培养方法已较成熟，但分离提纯后颗粒细胞的存活率仅在57.69T75.0%。本实验从细胞分离、纯化的多个环节用两种不同的方法进行比较，旨在建立一个更高效省时的颗粒细胞分离提纯方案。
【发明内容】
[0003]为克服上述技术问题，我们提出了以下技术方案:
一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法，将细胞沉淀后上层的白色黏液团小心吸出丢弃，余下细胞沉淀物重悬于等体积DMEM/F12培养液中。以2:3体积比将细胞悬液移至5
0% Percoll分离液的表面，500 Xg离心20 min;用移液管小心吸取界面层颗粒细胞，加入5倍体积的PBS，150 Xg离心3 min后弃上清；加入等体积胰酶，轻轻吹打混匀，室温消化I min以获取单细胞悬液，用2倍体积含FBS的DMEM/F12培养液终止消化；再次用PBS洗涤细胞，去除细胞表面附着的Percoll分离液和EDTA。用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞。
[0004]本发明中，对于所得的颗粒细胞，使用台盼蓝染色检测细胞存活率；血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/m I后，接种于24孔板，置于37°C、体积分数5% CO 2培养箱中培养，每24 h换液I次；分别于培养7 2h、96h、5d后光学显微镜下观察颗粒细胞形态。
[0005]本发明的有益效果是，对颗粒细胞存活率无明显影响，更为省时高效，有助于建立稳定的颗粒细胞体外培养体系。
【具体实施方式】
[0006]具体步骤为:将细胞沉淀后上层的白色黏液团小心吸出丢弃，余下细胞沉淀物重悬于等体积DMEM/F12培养液中。以2:3体积比将细胞悬液移至5 0 % Percoll分离液的表面，500 Xg离心20 min;用移液管小心吸取界面层颗粒细胞，加入5倍体积的PBS，150 Xg离心3 min后弃上清；加入等体积胰酶，轻轻吹打混匀，室温消化I min以获取单细胞悬液，用2倍体积含FBS的DMEM/F12培养液终止消化；再次用PBS洗涤细胞，去除细胞表面附着的Percoll分离液和EDTA。用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞；对于所得的颗粒细胞，使用台盼蓝染色检测细胞存活率；血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/m I后，接种于24孔板，置于37°C、体积分数5% CO 2培养箱中培养，每24 h换液I次；分别于培养7 2 h、9 6 h、5 d后光学显微镜下观察颗粒细胞形态。[0007]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法，其特征在于，将细胞沉淀后上层的白色黏液团小心吸出丢弃，余下细胞沉淀物重悬于等体积DMEM/F12培养液中；以2:3体积比将细胞悬液移至5 O % Percoll分离液的表面，500 Xg离心20 min;用移液管小心吸取界面层颗粒细胞，加入5倍体积的PBS, 150 X g离心3 min后弃上清；加入等体积胰酶，轻轻吹打混匀，室温消化I min以获取单细胞悬液，用2倍体积含FBS的DMEM/F12培养液终止消化；再次用PBS洗涤细胞，去除细胞表面附着的Percoll分离液和EDTA ;用含体积分数10%FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞。
2.如权利要求1所述的一种卵巢颗粒细胞分离提纯的简易方法，其特征在于，对于所得的颗粒细胞， 使用台盼蓝染色检测细胞存活率；血球计数板计算细胞浓度，调整细胞浓度为2 X 105/m I后，接种于24孔板，置于37°C、体积分数5% CO 2培养箱中培养，每.24 h换液I次；分别于培养7 2 h、9 6 h、5 d后光学显微镜下观察颗粒细胞形态。
【文档编号】C12N5/071GK103614335SQ201310519201
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】王景文 申请人:王景文