一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【专利摘要】本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。通过模板制备、引物设计、PCR扩增、公司测序等过程，获得了该基因的完整cDNA序列，其核苷酸序列具有177bp，编码的氨基酸序列具有58个氨基酸残基。研究淡水小龙虾的金属硫蛋白基因有助于进一步了解无脊椎动物对抗重金属离子胁迫的机制，以及解决目前水体环境重金属污染带来的养殖问题。
【专利说明】一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]无脊椎动物的免疫系统与脊椎动物的获得性免疫系统不同，被称为先天免疫系统。因此，无脊椎动物防御病原微生物入侵的免疫系统，都是源于自身遗传继承的固定的免疫模式，主要包括物理屏障、细胞免疫和体液免疫。当病原微生物入侵的时候，无脊椎动物首先是通过自己的体表以及消化道来进行物理防御，通过一个天然的物理屏障来阻挡病原微生物的侵染，但是，当特异的病原微生物通过这层物理屏障之后，进入到宿主体内的时候，就会激发宿主自身的细胞免疫与体液免疫作用，而且，这两种免疫形式几乎是同时发挥功能的。如果入侵的病原微生物体积较小，那么，宿主会通过细胞免疫中的吞噬作用来将其吞噬，从而达到清除的目的。当入侵的病原微生物体积较小，但是，数目较多的情况下，宿主就会通过细胞免疫中结节的形成以及包囊作用，将其大规模清除。当入侵的病原微生物体积较大的时候，宿主就会启动体液免疫相关的黑化作用，将其固定并且瓦解，从而达到清除的目的。此外，体液免疫还包括宿主细胞表面存在的模式受体介导的信号传导途径关联的抗菌肽的产生。通过物理屏障、细胞免疫和体液免疫三种形式的免疫作用，无脊椎动物防范着病原微生物的入侵。
[0003]除了病原微生物的侵染是无脊椎动物生存环境中需要面对的强大危险源之外，水产类的无脊椎动物(以 十足目中的甲壳类动物为例)生存环境中的重金属离子也是一个较为危险的刺激源。重金属离子对于甲壳类动物的胁迫作用主要是通过重金属离子在宿主体内的多个器官的积累，造成器官功能的丧失，从而使宿主死亡。同样，在这样的环境中生存的甲壳类动物体内也存在着一些可以对抗这样的刺激的基因与蛋白质，研究表明金属硫蛋白基因就是小龙虾体内存在的一个可以对抗重金属胁迫的免疫基因。金属硫蛋白基因是一类结构较为保守的基因，广泛存在于低等的无脊椎动物体内，其表达的产物是金属硫蛋白分子，这一类蛋白质的显著特点就是分子中富含半胱氨酸残基，这样就造成了对于金属离子具有较为强烈的亲和性，因此，金属硫蛋白分子的作用就是可以结合宿主体内的金属与重金属离子，从而达到清除金属与重金属离子的作用。目前，相关的体外试验研究结果显示，金属硫蛋白具有抗辐射、抗衰老、抗重金属中毒、清除自由基、提高机体的免疫能力、提高机体的应急能力、调节机体微量元素平衡的作用。
[0004]淡水小龙虾是我国主要的水产养殖品种之一，随着工业现代化发展的加快，出现了水体环境被频繁污染的情况，淡水小龙虾体内积累超量的金属离子甚至重金属离子，一方面会造成淡水小龙虾养殖业在经济方面的损失，另一方面会给相关消费者带了身体健康方面的隐患。因此，研究淡水小龙虾的金属硫蛋白基因有助于进一步了解无脊椎动物对抗重金属离子胁迫的机制，以及解决目前水体环境重金属污染带来的养殖问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的核苷酸序列，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码的氨基酸序列，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有58个氨基酸残基。
[0007]同时，本发明还提供该淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法。 [0008]本发明所提供的金属硫蛋白基因Pc-MT来源于淡水小龙奸(Procambarusclarkii)，命名为Pc-MT基因，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1，具有177bp。
[0009]上述金属硫蛋白基因Pc-MT编码的蛋白质来源于淡水小龙虫下(Procambarusclarkii)，命名为Pc-MT蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2，具有58个氨基酸残基。
[0010]上述淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，包括如下步骤:
[0011](I)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA,获得淡水小龙虾各个组织的总RNA样品；
[0012](2)以步骤(1)获得的总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾各个组织的cDNA样品；
[0013](3)设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0014]Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
[0015]Pc-MT-R: 5' ~TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG~3'
[0016]以步骤(2)中的淡水小龙虾各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0017](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0018](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0019]本发明的优点:
[0020]本发明涉及一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法。该基因在淡水小龙虾体内过量表达可以提高淡水小龙虾先天免疫系统中金属硫蛋白的表达量，从而可以提高淡水小龙虾对抗生存的水体环境中重金属离子的能力，提高繁殖与生存能力。
【具体实施方式】
[0021]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述
[0022]实施例1淡水小龙虾肝胰腺组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0023](I)选用淡水小龙虾肝胰腺组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得淡水小龙虾肝胰腺组织的总RNA样品；
[0024](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾肝胰腺组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾肝胰腺组织的cDNA样品；
[0025](3)设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0026]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0027]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0028]以步骤(2)中的淡水小龙虾肝胰腺组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0029](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切，并且与经过EcoR I和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET-28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾肝胰腺组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0030](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0031]实施例2淡水小龙虾血淋巴组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0032]( I)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用淡水小龙虾血淋巴抗凝剂作为佐剂，使用医用注射器从淡水小龙虾腹节中部抽取血淋巴组织液，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得淡水小龙虾血淋巴组织的总RNA样品；
[0033](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾血淋巴组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾血淋巴组织的cDNA样品；
[0034](3)设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0035]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0036]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0037]以步骤(2)中的淡水小龙虾血淋巴组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0038](4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET_28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子·送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾血淋巴组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。[0039](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0040]实施例3淡水小龙虾腮组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆
[0041](I)选用淡水小龙虾腮组织作为实验材料，利用上海生工生物工程有限公司提供的Total RNA Extractor (Trizol)动物总RNA快速抽提试剂盒进行总RNA的提取，获得淡水小龙虾腮组织的总RNA样品；
[0042](2)以步骤(1)获得的淡水小龙虾腮组织的总RNA样品作为模板，利用上海生工生物工程有限公司提供的一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾腮组织的cDNA样品；
[0043](3)设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
[0044]Pc-MT-F:5/ -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3;
[0045]Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3'
[0046]以步骤(2)中的淡水小龙虾腮组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产物；
[0047](4)将步骤(3)获得 的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET_28a载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虾腮组织中金属硫蛋白基因Pc-MT的基因序列。
[0048](5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
[0049]序列表
[0050]SEQ ID N0.1
[0051]内蒙古科技大学
[0052]一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT、其编码的氨基酸序列以及克隆方法
[0053]2013-10-22
[0054]2
[0055]I
[0056]177
[0057]cDNA
[0058]淡水小龙虾
[0059]淡水小龙虫下金属硫蛋白基因
[0060](1)...(177)
[0061 ] atgccgggtccctgttgtaaagacaagtgcgagtgtgccgagggcgggtgcaagactggc 60
[0062]tgtgtgtgcacctcatgccgctgtgcacgctgcgacaagtgtacgtcgcggtgcaagtgt 120
[0063]ccatccagggaggagtgtgccgagacctgctccaagccctgcaagtgctgtccctag 177
[0064]SEQ ID N0.2[0065]2
[0066]58
[0067]PRT
[0068]淡水小龙虾金属硫蛋白
[0069](1)...(58)
[0070]MPGPCCKDVCECAEGGCKTQCVCTSCRCAP
[0071]151015202530
[0072]CDKCTSGCKCPSKEECAKTCSKPCRCCP
[0073]31354045505558 。`
【权利要求】
1.一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID N0.1。
2.根据权利要求1所述的一种淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT，其特征在于，淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码的蛋白质对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。
3.—种权利要求1所述的淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)选用淡水小龙虾作为实验材料，利用动物总RNA提取试剂盒提取各组织总RNA，获得淡水小龙虾各个组织的总RNA样品； (2)以步骤(1)获得的总RNA样品作为模板，利用一步法RT-PCR扩增试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得淡水小龙虾各个组织的cDNA样品； (3 )设计扩增淡水小龙虾金属硫蛋白基因Pc-MT编码区的前后引物Pc-MT-F和Pc-MT-R:
Pc-MT-F: 5' -TACTCAGAATTCATGCCGGGTCCCTGTTGTA-3'
Pc-MT-R: 5' -TACTCACTCGAGCTAGGGACAGCACTTGCAG-3' 以步骤(2)中的淡水小龙虾各个组织的cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，反应的程序为:94°C预变性3min，94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得PCR反应产 物； (4)将步骤(3)获得的PCR反应产物进行回收、纯化，之后进行EcoRI核酸内切酶和Xho I核酸内切酶的双酶切处理，并且与经过EcoR I核酸内切酶和Xho I核酸内切酶双酶切处理的pET_28a大肠杆菌质粒载体连接，转化大肠杆菌DH5 α克隆菌株感受态细胞之后，进行菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆子送测序公司进行序列测定，获得淡水小龙虫下金属硫蛋白基因Pc-MT基因序列。 (5)将步骤(4)获得的基因序列，利用分子生物学Expasy在线软件(http://au.expasy.0rg)进行氨基酸序列的翻译,获得对应蛋白质的氨基酸序列。
【文档编号】C12N15/10GK103667302SQ201310534813
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】杜志强, 李新苍, 任乾 申请人:内蒙古科技大学