细菌耐药基因ndm-1的pcr检测引物及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及包含此引物的检测试剂盒。为了调查养殖场中的耐药细菌是否携带NDM-1基因，设计基因NDM-1的特异性PCR引物，优化PCR反应体系和条件，获得敏感性、特异性、重复性较高的细菌耐药基因NDM-1的PCR检测方法，该检测方法能检出的最低基因组DNA浓度为9.18×10-7μg/μL。本发明方法可作为畜禽养殖过程中携带耐药基因NDM-1细菌的早期诊断、快速筛查以及流行病学评估等手段，并可在当前兽医临床耐药细菌的监控防控中得到应用。
【专利说明】细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及畜禽养殖业的检测方法，具体涉及一种耐药基因NDM-1的PCR检测引物及应用。
【背景技术】
[0002]2010年8月11日，英国医学界宣称南亚出现了一种新型细菌，几乎对所有抗生素都有抗药性，被称为“超级细菌”。因首先在印度首都新德里出现又称为新德里金属-内酸胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-l, NDM-1)。NDM-1 不是一种细菌，而是编码金属-β -内酰胺酶(metallo-β -lacta-mase,MBL)的一种基因。随后,在英国、美国、比利时、法国、日本、澳大利亚等全球大多数国家发生了携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等细菌感染人并导致死亡病例，临床表现超级耐药现象。
[0003]携带NDM-1基因的细菌会产生一种特殊的β-内酰胺酶，且活性部位为金属离子，属于超广谱β -内酰胺酶的一种，这种酶可分解β -内酰胺环结构，可使任何含β -内酰胺环结构的抗生素失活，因此，携带这种酶的细菌可以抵抗所有含β_内酰胺环结构的抗生素，从而导致临床用药困难。
[0004]虽然各国学者对NDM-1基因的研究不断有文献报道，但主要集中在对人体的检测，并也只有从人体中检测出携带基因NDM-1的细菌，而在畜牧兽医方面的研究相对较少。NDM-1基因存在于DNA的结构中，被称为质粒。质粒可以在细菌中自由复制和移动，从而使各种菌种均有可能携带该NDM-1基因，具有传播和变异的惊人潜能。尽管我国畜牧业尚未出现携带NDM-1基因的耐药细菌，但携带NDM-1耐药细菌的出现也为我国畜牧业滥用抗生素敲响了警钟。那么，这种导致人类发病的“超级耐药细菌”在畜禽养殖场中到底是否存在？这需要建立相应的检测方法进行检测。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明建立“超级耐药细菌”NDM-1基因的PCR快速检测方法，调查畜禽养殖场中分离到的耐药细菌是否携带NDM-1基因。
[0006]本发明的目的在于提供一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物。
[0007]本发明的目的在于提供一种包含上述检测引物的细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒。
[0008]本发明所采用的技术方案如下:
一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物，其核苷酸序列分别如下所示:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO:1);
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC (SEQ ID NO:2)。
[0009]一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒，该试剂盒包含上述的检测引物。
[0010]本发明的有益效果是:O快速高效:整个检测只需PCR扩增和电泳检测即可完成；
2)操作简便:不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需进行常规的PCR即可；
3)高特异性:本发明对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌的DNA均不发生扩增；
本发明设计的特异性引物不与其他核酸序列发生错配，特异性高，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
4)闻灵敏度:本发明的最低检测极限可达到9.18 X 10 7 μ g/ μ L。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的特异性实验图；
图2为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的灵敏度实验图，从左到右的电泳泳道依次为 9.18Χ10-2μ g/μ L、9.18Χ10-3μ g/μ L、9.18Χ10-4μ g/μ L、9.18Χ10-5μ g/μ L、9.18Χ10-6μ g/μ L、9.18Χ10-7μ g/μ L、9.18Χ10-8μ g/μ L、9.18Χ10-9μ g/μ L 的阳性标准品的扩增结果；
图3为PCR扩增检测细菌耐药基因NDM-1的重复性实验。
【具体实施方式】
[0012]以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0013]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本`发明的保护范围之内。
[0014]实施例1:
一、特异性引物设计
根据GenBank已公布的细菌耐药基因NDM-1的序列(登录号:AB614355、FN396876、FR820590)，选取保守序列，设计用于检测细菌耐药基因NDM-1的特异性引物，预期扩增产物片段长度为241bp (SEQ ID NO:3)，其引物序列分别为:
引物:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO:1);
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC (SEQ ID NO:2)。
[0015]二、PCR扩增模板与阳性质控品的制备
人工合成细菌耐药基因NDM-1序列，利用常规方法将获得的基因NDM-1片断连接到T载体中，即为PCR扩增模板和阳性质控品。
[0016]三、基因NDM-1PCR扩增反应条件的优化
基因NDM-1的PCR扩增体系:在PCR反应管中分别加入灭菌水6 μ L,2XPCR Reagent10 μ L, 20pmol/y L NDM-1F I μ L,20pmol/y L NDM-1R I μ L，PCR 扩增模板 2 yL，共20 μL PCR扩增体系。
[0017]利用上述PCR扩增体系，运用正交法梯度性地改变变性温度和时间，退火温度和时间、延伸时间以及循环数等条件，确定基因NDM-1特异性引物的最佳循环扩增条件为:首先95 °C预变性5 min;然后94 °C, 15 s，65 °C,30 s，72 °C，15 s，共进行28个循环；最后72 °C延伸 5 min ；4 °C保存。
[0018]四、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增特异性实验
为了检测本发明PCR检测方法的特异性，分别对大肠埃希氏菌(ATCC29522)、肺炎克雷伯菌(CMCC (B) 46117)、阴沟肠杆菌(CMCC (B) 45301 )、铜绿假单胞菌(ATCC9027)等4株标准的菌株和NDM-1基因阳性质控品进行检测，分别提取各细菌的基因组DNA为模板，并以灭菌水为阴性对照，分析本PCR方法对基因NDM-1和其他常见畜禽细菌的基因检测情况。
[0019]检测方法采有上述“三”中的PCR扩增体系和条件，PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳显示，发现只有NDM-1基因阳性质控品PCR产物在240 bp左右出现了一条片段，与预期大小相符，而灭菌水对照、大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和铜绿假单胞菌都没有出现条带(如图1所示)。[0020]上述结果说明，本发明PCR检测方法能特异性扩增出细菌基因NDM-1的靶序列，而不与其它细菌核酸发生交叉反应。说明本发明方法特异性好，未出现假阳性。
[0021]五、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增灵敏度试验
用核酸测定仪测定阳性质控品基因组DNA的浓度为918μ g/mL，并将其按10的倍数进行系列稀释，分别稀释至浓度为 9.18Χ10-2μ g/ μ L、9.18Χ10-3μ g/ μ L、9.18Χ10-4μ g/μ L、9.18Χ 10-5μ g/μ L、9.18Χ 10-6μ g/μ L、9.18Χ 10-7μ g/μ L、9.18Χ 10-8μ g/μ L、9.18Χ 10_9μ g/μ L，采用上述“三”中的PCR扩增体系和条件，分别对稀释后不同浓度的阳性标准品进行扩增检测。
[0022]检测结果如图2所示，从左到右的电泳泳道依次为9.18Χ 10-2 μ g/ μ L、
9.18Χ 10-3μ g/ μ L、9.18Χ 10-4μ g/ μ L、9.18Χ 10-5μ g/ μ L、9.18Χ 10-6μ g/ μ L、
9.18Χ10-7μ g/yL、9.18Χ 10-8μ g/μ L、9.18Χ 10_> g/μ L 的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的PCR检测方法的灵敏度可达9.18Χ10_7μ g/μ L，表明本发明检测方法对细菌耐药基因NDM-1的诊断具有高度的灵敏性。
[0023]六、细菌耐药基因NDM-1 PCR扩增重复性试验
将8次独立重复提取含基因NDM-1阳性质控品的基因组DNA分别进行PCR扩增，经1.2%琼脂糖凝胶电泳显示，均出现了清晰明亮的目的条带(图3)，表明本发明的PCR检测方法具有良好的重复性和稳定性。
【权利要求】
1.一种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测引物，其核苷酸序列分别如下所示:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC ；
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC。
2.—种细菌耐药基因NDM-1的PCR检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。`
【文档编号】C12Q1/68GK103882106SQ201310554556
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】温肖会, 翟少伦, 魏文康, 吕殿红, 袁洁, 黄忠, 贾春玲, 周秀蓉, 曾琦雯 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所