经修饰的蛋白酶的制作方法

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经修饰的蛋白酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的蛋白酶,本发明还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。具体地,本发明涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌种)中的表达的方法。本发明公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。
【专利说明】经修饰的蛋白酶
[0001]本申请是申请日为2008年3月12日、发明名称为“经修饰的蛋白酶”的中国专利申请200880007877.6 (国际申请号PCT/US2008/003291)的分案申请。
发明领域
[0002]本发明提供了编码经修饰的蛋白酶的经修饰的多核苷酸以及改变微生物中蛋白酶生产的方法。具体地,本发明涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌种)中的表达的方法。本发明公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。
【背景技术】 [0003]微生物,例如是芽孢杆菌属成员的革兰氏阳性微生物,已被用于大规模的工业发酵,这部分是因为它们能将其发酵产物分进其培养基。分泌的蛋白穿过细胞膜和细胞壁被输出,随后再释放进外部培养基。多肽分泌进周质空间或其培养基依赖于多个参数,在工业发酵中需要对它们详加考虑。
[0004]事实上,异源多肽的分泌是工业界广泛使用的技术。典型地,用编码待表达且待分泌的目的异源多肽的核酸转化细胞,以生产大量的想要的多肽。该技术已用于生产大量的多肽。已可通过对编码想要的蛋白质的多核苷酸进行遗传操作,来控制想要的多肽的表达和分泌。虽然蛋白质生产方法已有若干进展,但是本领域中仍需要提供细胞外蛋白质分泌的有效方法。
[0005]发明概述
[0006]本发明涉及经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的蛋白酶,本发明还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。特别地,本发明涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌种)中的生产的方法。本发明公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。
[0007]本发明涉及经过遗传操作以增强经修饰蛋白质生产的多核苷酸、多肽和细胞。特别地,本发明涉及具有引入其中的外源核酸序列的革兰氏阳性微生物以及在此类宿主细胞(例如芽孢杆菌属的成员)中生产蛋白质的方法。更具体地,本发明涉及蛋白酶的生产以及经过遗传操作从而具有改变的生产表达的蛋白质的能力的细胞。特别地,本发明提供了微生物对蛋白酶的增强的生产。
[0008]在一些实施方式中,本发明提供了分离的经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的全长蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域(pro region)的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID N0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些实施方式中,经修饰的全长蛋白酶是丝氨酸蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其他实施方式中,全长蛋白酶是源于野生型或变体前体碱性丝氨酸蛋白酶的碱性丝氨酸蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ IDN0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在其它一些实施方式中,全长蛋白酶是源于野生型或变体前体碱性丝氨酸蛋白酶(其是克劳氏芽孢杆菌(B.Clausii)或缓慢葡萄球菌(S.1entus)碱性丝氨酸蛋白酶)的碱性丝氨酸蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109。在一些实施方式中,经分离的经修饰的多核苷酸包含SEQ ID NOS: 1、9或240所示的多核苷酸序列。
[0009]在一些实施方式中,本发明提供了经分离的经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的全长蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID N0:5、13和244的氨基酸位置28-108和109,其中,所述至少一处取代是在选自SEQ ID NO:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84 和 E88 的一处氨基酸位置进行的。在其它一些实施方式中,E33的氨基酸取代选自E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q和E33R。在其它一些实施方式中,E57的氨基酸取代选自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 E57N。
[0010]在一些实施方式中,本发明提供了经分离的经修饰的多核苷酸,其包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列,所述位置等同于SEQID NO: 5、13或244的氨基酸位置28-108和109。在另外一些实施方式中,经分离的经修饰的多核苷酸还包含编码包含成熟区域的全长蛋白酶的多核苷酸,其中,编码蛋白酶成熟区域的多核苷酸与SEQ ID N0S:8、16或247有至少大约70%同一性。
[0011]在一些实施方式中,本发明提供了包含经修饰的多核苷酸的至少一种载体,所述多核苷酸编码经修饰的全长蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109,或者,提供了包含经分离的经修饰的多核苷酸的至少一种载体,所述多核苷酸包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列,所述位置等同于SEQ ID NO:5、13或244的氨基酸位置28-108 和 109。
[0012]在其它一些实施方式中,本发明提供了经包含本发明的经修饰的多核苷酸的载体转化的宿主相比。在一些优选的实施方式中,经转化的宿主细胞是微生物。例如,在一些实施方式中,本发明提供了下述宿主细胞,所述宿主细胞经包含经修饰的下述多核苷酸的至少一种载体转化,所述多核苷酸编码经修饰的全长蛋白酶,其中,多核苷酸序列中编码全长前体蛋白酶的前区域的部分包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13和244的氨基酸位置28-108和109,或者,所述宿主细胞经分离的经修饰的下述多核苷酸转化,所述多核苷酸包含已被突变为编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的前体前序列,所述位置等同于SEQ ID N0:5、13或244的氨基酸位置28-108和1·09。在一些实施方式中,经本发明的多核苷酸转化的宿主细胞是选自芽抱杆菌属(Bacillus sp).、链霉菌属(Streptomyces sp.)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)和曲霉属(Aspergillus sp.)构成的组的微生物。在一些其它实施方式中,宿主细胞是枯草芽孢杆菌(B.subti I is)。[0013]在一些实施方式中,本发明提供了通过本发明的经转化的宿主细胞生产的蛋白酶。[0014]本发明还提供了在微生物中生产异源蛋白酶的方法,其中所述方法包含下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶。在一些实施方式中,通过芽孢杆菌宿主生产的蛋白酶被回收。本文提供的经修饰的多核苷酸中任何一种都可用于本发明的方法。
[0015]在一些实施方式中,本发明提供了在微生物中生产异源碱性丝氨酸蛋白酶的方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶。本发明还提供了在微生物中生产异源蛋白酶的下述方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶,所述经修饰的蛋白酶包含与SEQ ID N0S:8、16或247有至少大约70%同一性的成熟区域;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶。在一些实施方式中,芽孢杆菌宿主生产的蛋白质被回收。
[0016]在一些实施方式中,本发明提供了在微生物中生产异源蛋白酶的下述方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶,所述经修饰的蛋白酶包含下述前区域,所述前区域包含编码选自下述位置的至少一处氨基酸位置上的取代的突变,所述位置等同于SEQ ID NO: 5、13或244的氨基酸位置28-108和109;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶。在其它一些实施方式中,所述至少一处氨基酸取代选自E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q、E33R、E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 E57N。
[0017]本发明还提供了在微生物中生产是克劳氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌(B.1entus)蛋白酶的异源蛋白酶的方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶;以及(b )通过所述微生物来生产蛋白酶。
[0018]本发明还提供了在微生物中生产异源蛋白酶的下述方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养选自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.Amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪杆菌(B.stearothermophilus)、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、耐盐芽抱杆菌(B.halodurans)、凝固芽抱杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶。在一些实施方式中,所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌宿主细胞。
[0019]本发明还提供了在微生物中生产异源蛋白的下述方法,其中,所述方法包括下述步骤:(a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含经修饰的多核苷酸,所述多核苷酸编码经修饰的蛋白酶;以及(b)通过所述微生物来生产蛋白酶,并且,其中,所述异源蛋白酶展示出至少I的生产比例。
[0020]附图简述
[0021]图1A显示了来自克劳氏芽孢杆菌的野生型蛋白酶的全长多核苷酸序列(SEQ IDNO:1)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0022]图1B、C和D显示了多核苷酸序列(SEQ ID NO: 2、3和4),它们分别编码SEQ IDN0:5的全长克劳氏芽孢杆菌蛋白酶的信号肽(SEQ ID N0:6)、前区域(SEQ ID N0:7)和成熟形式(SEQ ID N0:8)。
[0023]图2A显示了来自克劳氏芽孢杆菌的野生型蛋白酶的全长多肽序列(SEQ IDN0:5)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0024]图2B、C和D显示了分别编码SEQ ID NO: 5的全长克劳氏芽孢杆菌蛋白酶的信号肽(SEQ ID N0:6)、前区域(SEQ ID NO:7)和成熟形式(SEQ ID N0:8)的多肽序列。
[0025]图3A显示了来自克劳氏芽孢杆菌的变体蛋白酶V049的全长多核苷酸序列(SEQID N0:9)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0026]图3B、C和D显示了多核苷酸序列(SEQ ID NO: 10、11和12),它们分别编码SEQID NO: 13的全长变体克劳氏芽孢杆菌蛋白酶的信号肽(SEQ ID NO: 14)、前区域(SEQ IDNO: 15)和成熟形式(SEQ ID NO: 16)。
[0027]图4A显示了来自克劳氏芽孢杆菌的变体蛋白酶V049的全长多肽序列(SEQ IDNO: 13)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0028]图4B、C和D显示了分别编码SEQ ID NO: 13的全长变体克劳氏芽孢杆菌蛋白酶的信号肽(SEQ ID NO: 14)、前区域(SEQ ID NO: 15)和成熟形式(SEQ ID NO: 16)的多肽序列。
[0029]图5显示了对SEQ ID NO: 5的克劳氏芽孢杆菌野生型丝氨酸蛋白酶、SEQ ID NO: 13的克劳氏芽孢杆菌变体丝氨酸蛋白酶和SEQ ID NO: 244的迟缓芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的比对。氨基酸的区别被下划线示出。
[0030]图6提供了包含SEQ ID NO:9的变体丝氨酸蛋白酶的pXX_049质粒载体的图谱。
[0031]图7A-D显示了用于本发明的pXX-049质粒载体的多核苷酸序列(SEQ ID NO: 17)。
[0032]图8A显示了来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的全长多核苷酸序列(SEQ ID N0:240)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0033]图8B、C和D显示了多核苷酸序列(SEQ ID NO:241、242和243),它们分别编码SEQ ID N0:244的迟缓芽孢杆菌前体蛋白酶的信号肽(SEQ ID N0:245)、前区域(SEQ IDNO: 246)和成熟形式(SEQ ID NO: 247)。
[0034]图9A显示了来自克劳氏芽孢杆菌的变体蛋白酶GG36的全长多肽序列(SEQ IDN0:244)。该序列中编码蛋白酶的前区域的部分以粗体字母显示。
[0035]图9B、C和D显示了分别编码SEQ ID NO: 244的全长迟缓芽孢杆菌蛋白酶的信号肽(SEQ ID N0:245)、前区域(SEQ ID NO:246)和成熟形式(SEQ ID NO:247)的多肽序列。
[0036]发明描述
[0037]本发明涉及经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的蛋白酶,本发明还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。·特别地,本发明涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌的种)中的表达的方法。本发明公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。[0038]本发明提供了经修饰的多核苷酸,其编码具有经突变的前区域的蛋白酶,本发明还提供了所述经修饰的多核苷酸编码的经修饰的蛋白酶以及用于生产它们的方法。经修饰的蛋白酶多核苷酸适于在微生物中表达经修饰的蛋白酶以及以比相应前体蛋白酶更高的水平对成熟形式进行加工。产生的蛋白酶可用于对适用于多种工业(包括但不限于:清洁、动物饲料和纺织品加工工业)的酶的工业生产。本发明还提供了生产这些酶的手段。在一些优选的实施方式中,本发明的蛋白酶是纯的或相对纯的形式。
[0039]除非另有指明,本发明的实践涉及分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序以及重组DNA领域通常所用的常规技术,它们在本领域技术范围内。此类技术是本领域技术人员已知的,它们被描述于大量的教材和参考文献中(见,例如 Sambrook et al.,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual〃,Second Edition (ColdSpring Harbor), [1989]和 Ausubel et al.,"Current Protocols in MolecularBiology"[1987])。本文中(包括上文和下文中)提到的所有专利、专利申请、文章和出版物都通过引用明确并入本文。
[0040]除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。例如,Singleton and Sainsbury, Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY(1994);和Haleand Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY(1991)为本领域技术人员提供了本发明所用的很多术语的一般性词典解释。虽然与本文的描述相似或等同的任何方法和材料都可用于本发明的实施,但本文描述了优选的方法和材料。因此,通过参考说明书整体能更完整地理解下文即将定义的术语。此外,在本文中使用时,除非上下文另有清楚指示,单数术语“一个/种”和“这个/种”(“a”、“an”和“the”)也包括复数指代。数值范围包括界定该范围的数字。除非另有指明,分别地,核酸是按照5’至3’的方向从左到右书写的;氨基酸是按照氨基到羧基的方向从左到右书写的。应当理解,本发明并不限于所述的特定的方法、方案和试剂,它们可根据本领域技术人员使用它们的背景而有所改变。
[0041]此外,本文提供的标题并非是对本发明的多个方面或实施方式的限制,它们可参照说明书整体而得到。因此,通过参考说明书整体能更完整地理解下文即将定义的术语。但是,为了协助理解本发明,下文定义了多个术语。
[0042]定义
[0043]“经修饰的蛋白酶”是具有下述氨基酸序列的全长蛋白酶,所述氨基酸序列源于全长“前体蛋白酶”的氨基酸序列。前体蛋白酶也可被称为“未经修饰的蛋白酶”。经修饰的蛋白酶在前区域与其前体蛋白酶有所不同。前体蛋白酶可以是天然存在的,即野生型的蛋白酶,或者其可以是变体蛋白酶。野生型或变体蛋白酶的前区域经过修饰,以产生经修饰的蛋白酶。经修饰的蛋白酶的氨基酸序列被认为是通过对前体氨基酸序列的前区域中一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入而“源于”所述前体蛋白酶氨基酸序列。在一些优选的实施方式中,前体蛋白酶的前区域的一个或多个氨基酸被取代,以产生经修饰的蛋白酶。此类修饰是对编码前体蛋白酶氨基酸序列的“前体DNA序列”的修饰,而非对前体蛋白酶本身进行的操作。本文中,经修饰的蛋白酶包括在前体蛋白酶的前区域的任何一处氨基酸残基处用19种天然存在的氨基酸中的任何一种进行的取代。在本文上下文中,“经修饰的”和“前体”蛋白酶都是包含信号肽、前区域和成熟区域的全长蛋白酶。编码经修饰的序列的多核苷酸被称为“经修饰的多核苷酸”,编码前体蛋白酶的多核苷酸被称为“前体多核苷酸”。“前体多肽”和“前体多核苷酸”可分别互换地称作“未经修饰的前体多肽”或“未经修饰的前体多核
苷酸”。
[0044]“天然存在的”或“野生型”指具有与自然界中所发现的相同的未经修饰的氨基酸序列的蛋白酶或编码所述蛋白酶的多核苷酸。天然存在的酶包括天然的酶,即在特定微生物中天然表达或发现的那些酶。野生型的或天然存在的序列指变体所源自的序列。野生型序列可编码同源或异源蛋白质。
[0045]在本文中使用时,“变体”指通过在C-末端和N-末端中任一或两者添加一个或多个氨基酸,在氨基酸中的一个或多个不同位点取代一个或多个氨基酸,在蛋白质的任一末端或两个末端或氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸,和/或在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸,而与其相应野生型蛋白质有所不同的前体蛋白质。本发明上下文中,通过克劳氏芽孢杆菌蛋白酶V049 (SEQ ID NO: 13)来示例变体蛋白质,其是天然存在的蛋白质Maxacal (SEQ ID N0:5)的变体。变体的前体蛋白可以是野生型或变体蛋白。
[0046]在本文中使用时,“等同于”指蛋白质或肽的列举的位置上的残基或者与蛋白质或肽的列举残基类似、同源或相应的残基。
[0047]在提到蛋白酶时,术语“生产”包括对全长蛋白酶的两个加工步骤,包括:1.除去信号肽,这已知在蛋白质分泌期间发生,和2.除去前区域,这产生了酶的活性成熟形式,并且已知在成熟过程期间发生(Wang et al., Biochemistry37:3165-3171 (1998) ;Power etal.,Proc Natl Acad Sci USA83:3096-3100(1986))。
[0048]在提到成熟蛋白酶时,术语“经加工的”指全长蛋白质(例如蛋白酶)所经历以成为活性成熟酶的成熟过程。
[0049]术语“活性比例”和“生产比例”可互换使用,用于表示从经修饰的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性与从未经修饰的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性之比。
[0050]术语“全长蛋白质”在本文中表示基因的一级基因产物,其包含信号肽、前序列和成熟序列。
[0051]术语“信号序列”或“信号肽”指可参与蛋白质的成熟或前体形式分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信号序列的该定义是功能性定义,其意欲包括参与实现蛋白质分泌的蛋白质基因N-末端部分编码的所有那些氨基酸序列。
[0052]术语“前序列”或“前区域”是信号序列和成熟序列之间的氨基酸序列,其对于蛋白酶的分泌/生产来说是必要的。将前序列切割掉将产生成熟活性蛋白酶。举例而言,本发明的蛋白酶的前区域至少包括与SEQ ID N0:5、13或244的28-111位残基相同的氨基酸序列。
[0053]术语“成熟形式”或“成熟区域”指蛋白质的最终功能性部分。举例而言,本发明的蛋白酶的成熟形式至少包括与SEQ ID NO:5、13或244的112-380位残基相同的氨基酸序列。在本文上下文中,“成熟形式”“加工自”全长蛋白酶,其中,对全长蛋白酶的加工包括除去信号妝和除去如区域。
·[0054]在本文中使用时,术语“异源蛋白”指不在宿主细胞中天然存在的蛋白质或多肽。相似地,“异源多核苷酸”指不在宿主细胞中天然存在的多核苷酸。
[0055]在本文中使用时,“同源蛋白”指在细胞中是天然的或天然存在的蛋白质或多肽。相似地,“同源多核苷酸”指在细胞中是天然的或天然存在的多核苷酸。
[0056]在本文中使用时,术语“启动子”指指导下游基因转录的核酸序列。在一些优选的实施方式中,启动子适合于其中将要表达靶基因的宿主细胞。启动子与其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起,是表达给定基因所必需的。通常,转录和翻译调控序列包括但不限于:启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或活化序列。
[0057]当核酸相对另一核酸序列以功能性关系放置时,其被称为“有效连接的”。例如,如果启动子或增强子能影响编码序列的转录,它们就是与编码序列有效连接的;或者,如果核糖体结合位点被放置为能协助翻译,它就是与编码序列有效连接的。通常,“有效连接的”指相连的DNA序列是毗邻的。
[0058]在本文中使用时,术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指展示出能水解肽或具有肽键的底物的能力的蛋白质或肽。已有很多公知方法用于测量蛋白质水解活性(Kalisz,"Microbial Proteinases, 〃In:Fiechter(ed.).Advances in BiochemicalEngineering/Biotechnology, [1988])。例如,可通过比较检验(分析产生的蛋白酶水解商业底物的能力)来确定蛋白水解活性。可用于此类蛋白酶或蛋白水解活性分析中的示例性底物包括但不限于:二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。利用这些底物的比色检验是本领域公知的(见,例如,W099/34011和美国专利号6,376,450,它们都通过引用并入本文)。AAPF 检验(见,例如 Del Mar et al.,Anal.Biochem.,99:316_320[1979])也可用于测定成熟蛋白酶的生产。该检验测量该酶水解可溶的合成底物一琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(sAAPF-pNA)时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上于410nm测量从水解反应产生黄色的速率,其与活性酶浓度成比例。
[0059]在本文中使用时,“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有种,其包括但不限于,枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌(B.1autus)和苏云金芽孢杆菌。应当认识到,芽孢杆菌属还将继续经历分类重构。因此,该属包括已经被重新分类的物种,这包括但不限于嗜热脂肪杆菌等生物,其现在被称为“Geobacillusstearothermophilus”。存在氧时产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的界定特征,虽然该特征也适用于近来命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、AneurinibaciIIus> Anoxybacillus、Brevibacillus、Filobacillus、Gracilibacillus、Halobacillus、类芽抱杆菌属(Paenibacillus)、Salibacillus、热杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus 和 Virgibacillus。
[0060]术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用,它们指任何长度的核苷酸聚合形式。这些术语包括但不限于,单链DNA、双链DNA、基因组DNA、cDNA或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学修饰的、经生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、染色体片段、ESTs、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核糖体、cDNA、重组多核苷酸、带分支的多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。
[0061]在本文中使用时,术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换使用,以表示用于将序列引入宿主细胞或生物的DNA。DNA可通过PCR或本领域技术人员已知的任何其它合适技术体外产生。在一些特别优选的实施方式中,DNA构建体包含目的序列(例如,经修饰的序列)。在一些实施方式中,所述序列与另外的元件,例如,控制元件(例如启动子等)有效连接。在一些实施方式中,DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其它一些实施方式中,DNA构建体包含非同源序列。一旦DNA构建体被体外装配,其即可用于突变宿主细胞染色体的区域(即,用异源序列代替内源序列)。
[0062]在本文中使用时,术语“载体”指设计来向一种或多种细胞类型中引入核酸的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体和质粒。在一些实施方式中,多核苷酸构建体包含编码全长蛋白酶的DNA序列(例如,经修饰的蛋白酶或未经修饰的前体蛋白酶)。
[0063]在本文中使用时,术语“质粒”指用作为克隆载体的环状双链(ds ) DNA构建体,其在一些真核生物或原核生物中形成染色体外的自主复制遗传元件,或整合进宿主染色体。
[0064]在本文中使用时,在向细胞中引入核酸序列的上下文中,术语“引入”表示适用于将核酸序列转入细胞的任何方法。用于引入的此类方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(见,例如,Ferrari et al.,"Genetics, "in Hardwood etal, (eds.), Bacillus.Plenum Publishing Corp., pages57-72, [1989])。
[0065]在本文中使用时,术语“经转化的”和“稳定转化的”指这样的细胞,它们具有整合进其基因组中的或作为保持了至少两代的游离型质体存在的非天然(异源)多核苷酸序列。
[0066]本发明提供了经分离的经修饰的编码氨基酸序列的多核苷酸,其编码经修饰的蛋白酶。通过对前体蛋白酶的多核苷酸序列加以突变,获得经修饰的蛋白酶。具体地,对编码前体蛋白酶的前区域的多核苷酸序列进行一处或多处突变,以提供本发明的经修饰的多核苷酸。
[0067]发明详述
[0068]本发明涉及经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的蛋白酶,本发明还涉及改变微生物中蛋白酶生产的方法。特别地,本发明涉及改变蛋白酶在微生物(例如芽孢杆菌属的种)中的表达的方法。本发明公开了经修饰的多核苷酸、载体、经修饰的多肽和增强蛋白酶生产的方法。
[0069]在一些实施方式中,本发明提供了编码经修饰的蛋白酶的经修饰的多核苷酸,所述经修饰的蛋白酶源于动物、植物或微生物来源的野生型或变体前体蛋白酶。编码源于微生物的前体蛋白酶的多核苷酸是优选的,其包含编码野生型前体蛋白酶和变体前体蛋白酶(源于野生型形式)的多核苷酸。在一些实施方式中,本发明的经修饰的多核苷酸源于编码微生物来源的前体蛋白酶的多核苷酸。本发明还包括源于编码蛋白工程化的前体的多核苷酸的、编码经修饰蛋白酶的多核苷酸。编码丝氨酸蛋白酶的多核苷酸是优选的前体蛋白酶多核苷酸,其中碱性微生物蛋白酶多核苷酸是特别优选的。丝氨酸蛋白酶是催化其中在活性位点有关键丝氨酸残基的肽键水解的酶。丝氨酸蛋白酶具有大约25,000至30,000范围内的分子量(见Priest, Bacteriol.Rev.,41:711-753 [1977])。在一些优选的实施方式中,编码枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)和枯草杆菌蛋白酶变体的多核苷酸是优选的前体丝氨酸蛋白酶多核苷酸。在一些实施方式中,本发明包括编码经修饰的蛋白酶的下述多核苷酸,它们源于微生物,例如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和耐盐芽孢杆菌的多核苷酸。编码枯草杆菌蛋白酶的多种芽孢杆菌多核苷酸已被鉴定和测序,例如,枯草杆菌蛋白酶168、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶DY、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶309 (见,例如EP414279B ;W089/06279 和 Stahl et al., J.Bacteriol.,159:811-818[1984],它们每篇都通过引用整体并入本文)。在本发明的一些实施方式中,突变体(例如变体)蛋白酶多核苷酸作为编码本发明的经修饰的蛋白酶所源自的蛋白质的前体多核苷酸。多篇参考文献提供了变体蛋白酶的例子(见,例如,W099/20770 ;W099/20726 ;W099/20769 ;W089/06279 ;RE34, 606 ;美国专利号4,914,031 ;美国专利号4,980,288 ;美国专利号5,208,158 ;美国专利号5,310,675 ;美国专利号5,336,611 ;美国专利号5,399,283 ;美国专利号5,441,882 ;美国专利号5,482,849 ;美国专利号5,631,217 ;美国专利号5,665,587 ;美国专利号5,700, 676 ;美国专利号5,741,694 ;美国专利号5,858,757 ;美国专利号5,880,080 ;美国专利号6,197,567和美国专利号6,218,165 ;它们每篇都通过引用整体并入本文)。在其它一些实施方式中,本发明所包括的多核苷酸包括:源于编码可商业获得的蛋白酶的多核苷酸的经修饰的多核苷酸。例如,可商业获得的蛋白酶包括但不限于:ALCALASE?、SAVINASE?、PRIMASE?、DURALASE?、ESPERASE? 和 KANNASE? (Novo Nordisk AJS),MAXATASE?、MAXACAL?、MAXAPEM?、PROPERASE?、PURAFECT? 和 PURAFECT OXP? (GenencorInternational Inc.)。在一些实施方式中,本发明包括源于编码来自克劳氏芽孢杆菌的前体蛋白酶的多核苷酸的经修饰的多核苷酸。在其它一些实施方式中,本发明包括源于编码来自迟缓芽孢杆菌的前体蛋白酶的多核苷酸的经修饰的多核苷酸。
[0070]在一些实施方式中,本发明的经修饰的全长多核苷酸包含编码已突变的前体蛋白酶前区域的序列。编码任何合适的前体蛋白酶的前区域的多核苷酸序列可用于产生本发明的一种或多种经修饰的多核苷酸。在一些优选的实施方式中,前体多核苷酸序列的编码前区域的部分被突变,以编码位于下述位置的一处或多处氨基酸取代,所述位置等同于SEQID N0:5、13或244的1-109位。在一些实施方式中,经修饰的前体多核苷酸编码前区域中位于下述位置的至少一处氨基酸取代,所述位置等同于SEQ ID N0:5、13或244的E33、E43、A44、E47、V49、E57、A59、E63、E70、E74、E84和E88。在一些实施方式中,编码等同于 E33 的位置处的氨基酸的多核苷酸序列被突变为编码取代E33D、E331、E33S、E33N、E33K、E33H、E33Q或E33R中的至少一种。在一些其它实施方式中,编码等同于E57的位置处的氨基酸的多核苷酸序列被突变为编码取代E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H 和 / 或 E57N 之一。
[0071]在一些实施方式中,前体克劳氏芽孢杆菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQ ID NO:1)编码野生型蛋白酶(MAXACAL? ;SEQ ID NO:5)。
[0072](SEQ ID NO:1)
[0073]ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGA·AGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGC
TGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACT
TAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTG
GCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAA
AGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGC
ACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGA
GGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAAT
GGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCAC
CAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCAT
GTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAA
TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA
[0074](SEQ ID NO:5)
[0075]MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0076]在其它一些实施方式中,前体克劳氏芽孢杆菌蛋白酶多核苷酸(例如SEQ ID NO:9)编码变体蛋白酶(例如,SEQ ID NO:13)
[0077](SEQ ID NO: 13)
[0078]VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0079]在其它实施方式中,前体蛋白酶多核苷酸是迟缓芽孢杆菌的多核苷酸(例如SEQID NO:240),其编码 SEQ ID NO:244 的蛋白酶 GG36。
[0080] (SEQ ID NO:240)
[0081]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTCTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGCTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAAT
GGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCAC CAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCAT
GTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAA
TACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGT
[0082](SEQ ID NO:244)
[0083]MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0084]在一些实施方式中,本发明提供了源于SEQ ID NO:9的全长前体多核苷酸的经修饰的全长多核苷酸。
[0085](SEQ ID NO:9)
[0086]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAA
[0087]SEQ ID NO:9的多核苷酸序列包含序列(SEQ ID NO:10),当其表达时,被用来编码信号序列肽(SEQ ID NO: 14),其跨越SEQ ID NO:13的1_27位氨基酸;N_末端前序列(SEQID NO: 11),其编码前区域序列(SEQ ID NO: 15),其跨越SEQ ID NO: 13的28-111位氨基酸残基;以及成熟的丝氨酸蛋白酶序列(SEQ ID N0:12),其编码SEQ ID NO: 13的112-380位氨基酸残基(即,SEQ ID N0:16)。编码SEQ ID NO:13的蛋白酶的信号肽的前8个氨基酸的多核苷酸序列是编码枯草芽孢杆菌AprE蛋白酶的前8个氨基酸的序列。
[0088](SEQIDN0:10)
[0089]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT[0090](SEQ ID NO:15)
[0091]AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
[0092](SEQ ID NO:14)
[0093]VRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA
[0094](SEQ ID NO:11)
[0095]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG
[0096](SEQ ID NO:12)
[0097]GCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGTTATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGACTGCAGGCACCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGTTAA
[0098](SEQ ID NO:16)
[0099]AQSVPffGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASPVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSS1AQGLEWAGNNVMHVANLSLGLQAPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQ1RNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0100]在其它一些实施方式中,本发明提供了源于SEQ ID NO:1的野生型全长前体多核苷酸的经修饰的全长多核苷酸。SEQ ID NO:1的多核苷酸包含:序列SEQ ID NO:2,当表达时,其用于编码信号序列肽(SEQ ID NO:6),其编码SEQ ID NO:5的1_27位氨基酸;N-末端前序列(SEQ ID NO:3),其编码SEQ ID NO:5的28-111位氨基酸残基(即,SEQ ID NO:7)和野生型成熟丝氨酸蛋白酶序列(SEQ ID NO:4),其编码SEQ ID NO: 5的112-380位氨基酸残基(即,SEQ ID NO:8)。
[0101](SEQ ID NO:2)
[0102]ATGAAGAAACCGTTGGGGAAAATTGTCGCAAGCACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT
[0103](SEQ ID NO:6)
[0104]MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA·[0105](SEQ ID NO:3)[0106]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAACTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATG
[0107](SEQ ID NO:7)
[0108]AEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEIELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTM
[0109](SEQ ID NO:4)
[0110]GCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCTGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCACCGAACGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGGAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCGGCAACACGCTAA
[0111](SEQ ID NO:8)
[0112]RVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPNAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR
[0113]在其它一些实施方式中,本发明提供了源于SEQ ID NO:240的变体全长前体多核苷酸的经修饰的全长多核苷酸。SEQ ID NO:240的多核苷酸包含:SEQ ID NO:241的序列,当表达时,其用于编码信号序列肽(SEQ ID NO:245),编码SEQ ID NO:244的1_27位氨基酸;N-末端前序列(SEQ ID NO:242),其编码SEQ ID NO:244的28-111位氨基酸残基(SP,SEQ ID NO:246);和野生型成熟丝氨酸蛋白酶序列(SEQ ID NO:243),其编码SEQ ID NO:244的112-380位氨基酸残基(即,SEQ ID NO:247)。编码SEQ ID NO:244的前体蛋白酶的信号肽的前8个氨基酸的多核苷酸序列是编码枯草芽孢杆菌AprE蛋白酶的前8个氨基酸的序列。前体GG36的前蛋白和成熟部分由GG36野生型序列编码。
[0114](SEQ ID NO:241) [0115]GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTTAGTTCATCGATCGCATCGGCT
[0116](SEQ ID NO:245)MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASA
[0117](SEQ ID NO:242)
[0118]GCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGA
【权利要求】
1.分离的经修饰的多核苷酸,其编码经修饰的全长蛋白酶,其中所述经修饰的全长蛋白酶选自 SEQ ID NO: 13 并且包含选自 E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H、E57N和E57G之一的突变,其中所述突变导致所述经修饰的全长蛋白酶与前体蛋白酶相比具有增强的生产活性。
2.权利要求1的分离的经修饰的多核苷酸,其中所述经修饰的全长蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
3.权利要求1的分离的经修饰的多核苷酸,其中所述经修饰的全长蛋白酶是源于野生型或变体前体碱性丝氨酸蛋白酶的碱性丝氨酸蛋白酶。
4.权利要求1的分离的经修饰的多核苷酸,其中所述前体碱性丝氨酸蛋白酶是克劳氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶。
5.包含权利要求1一 4任一项的经修饰的多核苷酸的载体。
6.用权利要求5的载体转化的宿主细胞。
7.权利要求6的宿主细胞,其中所述宿主细胞是微生物。
8.权利要求6的宿主细胞,其中所述宿主细胞是选自芽孢杆菌属、链霉菌属、埃希氏菌属和曲霉属的微生物。
9.权利要求6-8任一项的宿主细胞,其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。
10.权利要求6-8任一项的宿主细胞产生的蛋白酶。
11.在微生物中产生异源蛋白酶的方法,所述方法包括步骤:` (a)在合适的条件下培养芽孢杆菌宿主细胞,其中,所述芽孢杆菌宿主细胞包含编码经修饰蛋白酶的经修饰的多核苷酸;以及 (b)允许所述微生物产生所述蛋白酶, 其中所述经修饰的全长蛋白酶选自SEQ ID NO: 13并且包含选自E57F、E57W、E57K、E57R、E57D、E57M、E57C、E57Q、E57S、E57H、E57N 和 E57G 之一的突变。
12.权利要求11的方法,其中回收所述芽孢杆菌宿主产生的所述异源蛋白酶。
13.权利要求11的方法,其中所述蛋白酶是碱性丝氨酸蛋白酶。
14.权利要求11-13任一项的方法,其中所述宿主细胞选自地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
15.权利要求11-13任一项的方法,其中所述异源蛋白酶是克劳氏芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌蛋白酶。
16.权利要求11-13任一项的方法,其中所述异源蛋白酶显示出至少为I的生产比例,其中生产比例表示从经修饰的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性与从未经修饰的蛋白酶加工的成熟蛋白酶的酶促活性之比。
【文档编号】C12N15/75GK103667323SQ201310559596
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2008年3月12日 优先权日:2007年3月12日
【发明者】D·A·埃斯特尔, E·费拉里 申请人:丹尼斯科美国公司
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