一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株及其制备方法
【专利摘要】本发明属于白血病细胞株【技术领域】。本发明提供了一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC?NO：C2013103，于2013年8月1日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了上述白血病细胞株NT-1的制备方法以及应用。本发明对人不典型慢性粒细胞性白血病的诊断和治疗提供了新的思路，对建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病模型，对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。
【专利说明】一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于白血病细胞株【技术领域】，具体涉及一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1及其制备方法。
【背景技术】
[0002]白血病细胞株在白血病的基础研究中具有重要的地位，采用细胞株在体外进行实验及动物模型的构建，不仅能从分子、基因水平深入研究肿瘤发生和发展机理，而且对临床的早期诊断、药物筛选和治疗具有重要意义。
[0003]目前国内外文献报道，并常用于白血病诊断及治疗研究的白血病细胞株包括:人早幼粒急性白血病细胞株HL-60、人慢性髓系白血病细胞株K562等。
[0004]人不典型慢性粒细胞性白血病(英文全称，简称aCML)，为慢性白血病中的一种罕见类型，起病缓慢，早期多无明显症状，往往在体格检查或其他疾病就诊时偶然发现脾肿大或白细胞异常，早期诊断困难。目前临床也没有较佳的治疗方案，预后差，中位生存年龄仅14-25个月。骨髓细胞染色体核型异常可高达80%，最常见的是+8和del (20q)，20-40%的患者演变为急性白血病，其余患者常死于骨髓衰竭。到目前为止，对aCML的治疗经验很少，尚无满意的治疗方法。目前报道应用地西他滨治疗aCML，7例患者中有4例获得血液学改善，主要不良反应是重度骨髓抑制。
[0005]因此，筛选并 获得稳定的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株，建立体外的aCML模型，将对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，本发明另一目的在于提供该人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法及其应用。
[0007]本发明的第一方面，是提供了一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO:C2013103，于2013年8月I日保藏于中国典型培养物保藏中心。
[0008]本发明人从一名不典型慢性粒细胞性白血病(aCML)患者的骨髓中获得该白血病细胞株的原代细胞。
[0009]本发明应用体外细胞培养技术建立人髓系细胞株，采用细胞株作为实验对象，分析细胞的形态学、遗传学、免疫表型、裸鼠致瘤率等特点，为进一步研究aCML的发病机制及治疗提供有效且稳定的细胞模型。
[0010]本发明的第二方面，是提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0011]1.原代培养:
[0012]抽取该患者骨髓l_5ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液加入10_30ml锥形离心管中，升至室温(18_25°C );将离心管倾斜45°，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上Icm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心15-30分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10-20mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10_20min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入MDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37°C，5 %二氧化碳培养箱内。
[0013]2.传代:
[0014]将在IMDM完全培养基中的悬浮细胞，培养于培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代:在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,弃上清，加入MDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入培养皿。
[0015]3.冻存和复苏
[0016]冻存:冻存前24小时更换新鲜的MDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,离心5_10分钟，弃上清，加入含MDM完全培养基，调整细胞浓度为1*106~2*106/ml，分装细胞悬液至EP管，每管 为Iml细胞悬液，大约1*106~2*106个细胞数，再次离心，1500r/min,离心5-10分钟，弃上清，细胞沉淀加入l_3ml冻存液，吹打均匀，移入无菌冻存管，4°C 30分钟，-200C 60分钟，_80°C过夜，次日移入液氮。
[0017]复苏:从液氮中取出冻存管，迅速置于37°C温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min,离心10_20min，弃去上清液，细胞沉淀加IMDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿，置37°C，5%C02，95%湿度的CO2培
养箱中培养。
[0018]本发明涉及的培养液配方如下:
[0019]IMDM完全培养基(即含20%胎牛血清的MDM完全培养基)=IMDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml,链霉素100ug/ml。
[0020]IMDM培养基:可购自Sigma公司12440 (高糖，添加L-谷氨酰胺及丙酮酸钠)。
[0021]冻存液(使用前现配):细胞冻存液含90%的胎牛血清和10%的DMS0。
[0022]本发明的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，能在体外长期生长和无限传代，细胞生长状态良好，呈单细胞悬浮生长，不依赖任何细胞生长因子和基质细胞而持续生长，能耐受冻存和复苏，该细胞株携带有47, XX, +8/47, XX, idem, t (5 ；12) (q31 ；pl3),目前国内外文献均未有报道该类细胞株。
[0023]目前在中国典型培养物保藏中心保藏的是本发明培养的第55代、第60代NT-1细胞株。
[0024]本发明的NT-1细胞株通过细胞形态学、免疫分型检测，证实是一株髓系的白血病细胞株，该细胞株倍增时间为72小时，增殖速度中等，细胞周期检测显示S期细胞所占比例为20.28%，Gl期细胞所占比例为77.79%，G2期细胞所占比例为1.93%，由此可见，NT-1细胞株生长旺盛。PCR检测NT-1细胞株有p53基因的突变，扩增片段测序结果显示4号外显子第215位碱基存在点突变，由CCC-CGC，相应的氨基酸由脯氨酸变成了精氨酸。
[0025]选取D8S1179、D21S11、D18S51、CSF1P0、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、D7S820、D18S51、vWA、TP0X、X/Y、D5S818、FGA 等 16 个 STR 位点，有 15 个
位点基因型与原代细胞的信号相一致，证明NT-1细胞株与患者基因型为同一来源，排除了细胞株之间污染的可能。
[0026]经裸鼠致瘤实验证实本发明的NT-1细胞株具有致瘤性，将同等数量的细胞接种6只Balb/c裸鼠(3雄3雌)，一个月后4只形成了大小不等的肿瘤，剥离肿瘤，行病理切片、瑞氏染色、免疫分型等检查，证实了肿瘤与NT-1细胞株的一致性，是真正的白血病细胞株。
[0027]本发明的第三方面，是提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病动物模型中的应用。
[0028]提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
[0029]以及，提供了上述的一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。
[0030]本发明对aCML的诊断和治疗提供了新的思路，对建立体外的aCML模型，对人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断及药物筛选具有重要意义。
[0031 ] 生物材料样品的保藏信息:
[0032]保减单位:中国典型培养物保减中心
[0033]地址:中国武汉武汉大学
[0034]保藏日期:2013年 8月I日
[0035]保藏编号:CCTCCNO:C2013103
[0036]分类命名:人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为NT-1细胞株的瑞氏染色电镜图。
[0038]细胞大小不一(20-30微米)，圆形或椭圆形；胞核圆形或椭圆形,部分核折叠、扭曲、凹陷，核染色质部分呈细粒状，部分呈疏松网状，可见不规则核仁，部分胞浆无颗粒，部分胞浆伴细沙状颗粒，胞浆呈灰蓝色，偶见空泡。
[0039]图2为NT-1细胞株的生长曲线，NT-1细胞增殖能力中等，用CCK-8试剂盒制成的标准曲线及生长曲线，其倍增时间为72小时。
[0040]其中A是NT-1细胞株的标准曲线，B是NT-1细胞株的生长曲线。
[0041]图3为NT-1细胞株的细胞周期。
[0042]图4为NT-1细胞株的染色体核型分析图，核型如下:47, XX，+8/47, XX, idem, t (5 ;12) (q31 ;pl3)。
[0043]图5为NT-1细胞株在裸鼠体内形成的肿瘤组织HE染色(A)及pox染色⑶。【具体实施方式】
[0044]现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
[0045]下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
[0046]实施例1:人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的获得
[0047]1.原代培养[0048]抽取该患者骨髓2ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(购自上海普飞公司)加入15ml锥形离心管中，升至室温(18-25°C);将离心管倾斜45度角，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上Icm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心20分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有IOmlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心lOmin，弃上清，重复洗涤1_2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入MDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；直于37 C，5 % 二氧化碳培养箱内。
[0049]2.传代
[0050]该细胞为悬浮细胞，培养于IOCM培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代:在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min，弃上清，加入MDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入IOcm培养皿。
[0051]3.冻存和复苏
[0052]冻存:冻存前24小时更换新鲜的MDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,弃上清，加入MDM完全培养基，调整细胞浓度为2*106/ml，分装细胞悬液至EP管，每管为Iml细胞悬液，大约2*106个细胞数，再次离心，1500r/min,弃上清，细胞沉淀加入1.5ml冻存液悬浮，移入无菌冻存管，将冻存管口封严，贴上标签，注明细胞种类、冻存日期、冻存者。4°C 30分钟，-200C 60分钟，_80°C过夜，次日移入液氮。
[0053]复苏:从液氮中取 出冻存管，迅速置于37°C温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心lOmin，弃去上清液，细胞沉淀加5mlIMDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿，置37°C，5%C02，95%湿度的CO2培
养箱中培养。
[0054]目前中国典型培养物保藏中心保藏的是我们培养的第55代、第60代NT-1细胞株。
[0055]本发明涉及的培养液配方如下:
[0056]MDM完全培养基:MDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml,链霉素IOOug/ml ο
[0057]IMDM培养基:购自Sigma公司12440型号(高糖，添加L-谷氨酰胺及丙酮酸钠)。
[0058]冻存液(使用前现配):细胞冻存液含90%的胎牛血清和10%的DMSO (购自南京凯基公司)。
[0059]实施例2:人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的生长及遗传特性鉴定
[0060]1.细胞形态学观察
[0061]取一定数量的细胞转移入1.5ml离心管(EP管)，1500r/min，离心5分钟，弃2/3上清，剩余细胞悬液吹打均匀后涂片，行瑞氏染色，细胞大小不一(20-30微米)，圆形或椭圆形；胞核圆形或椭圆形，部分核折叠、扭曲、凹陷，核染色质部分呈细粒状，部分呈疏松网状，可见不规则核仁，部分胞浆无颗粒，部分胞浆伴细沙状颗粒，胞浆呈灰蓝色，偶见空泡(见图I)。
[0062]2.NT-1细胞株生长曲线
[0063]制作标准曲线:
[0064](I)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞；
[0065](2)按1/2比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，做5个细胞浓度梯度，每组设3个复孔；
[0066](3)接种后培养4小时，然后加CCK8试剂继续培养一段时间，等颜色发生明显变化后，用酶标仪进行测定，得到0.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，0.D值为纵坐标(Y轴)的标准曲线(图2A)。
[0067]细胞增殖检测:
[0068](I)在96孔板中配制100微升的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37°C，5%C02的条件下)；
[0069](2)向每孔加入10微升CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响0.D值的读数)。
[0070](3)将培养板在培养箱内分别孵育24、48、72、96、120、144小时。4.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，得到一条时间与OD值之间的生长曲线，其倍增时间为72小时(图2B)。
[0071]3.NT-1细胞株的细胞周期
[0072]取对数生长期NT-1细胞I X IO6,约1ml，离心，弃上清，加_20°C保存的冰乙醇混匀固定，4度过夜，离心，弃上清，PBS洗涤2次，RNase作用15分钟，加PI (碘化丙啶)、精胺作用15分钟，调整细胞浓度为1\106/!111，上机检测(流式细胞仪)，分析结果显示:S期细胞所占比例为20.28%，Gl期细胞所占比例为77.79%，G2期细胞所占比例为1.93%，由此可见，NT-1细胞生长旺盛(见图3)。
[0073]4.NT-1细胞株的免疫表型
[0074]细胞株体外培养8个月后取对数生长期细胞应用流式细胞仪(FCM)进行检测，直接免疫荧光法标记细胞，流式细胞计数仪5000个细胞，测定百分率。检测单克隆抗体T系抗原 CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8 ；B 系抗原 CD10、CD19、D20、CD22 ;髓系抗原 D13、CD14、CD15、CD33、MPO ;巨核系抗原 CD41、CD61 ;干细胞抗原 CD34、HLA-DR、CDl 17 以及 CD16/56、⑶25、⑶203等，所有单抗均为BD公司产品。NT-1细胞主要表达髓系、自然杀伤系抗原，干细胞祖标记⑶34表达呈阳性,而T和B淋系的标志抗原达表阴性(见表1)。
[0075]表1:免疫表型
[0076]
【权利要求】
1.一种人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1，其保藏号为CCTCC NO:C2013103,于2013年8月I日保藏于中国典型培养物保藏中心。
2.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1的制备方法，该方法包括以下步骤: A、原代培养: 抽取该患者骨髓l_5ml，枸橼酸钠抗凝；用等体积的PBS液稀释全血；取等体积的Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液加入10_30ml锥形离心管中，升至室温；将离心管倾斜，用玻璃吸管吸取稀释后的血液样品，在分层液面上Icm处沿着管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，注意勿打乱液层界面；配平后置于水平离心机，在室温下2000r/min，离心15-30分钟；将离心管平稳取出，血浆层与分层液交界处为一浑浊的灰白色层，富含单个核细胞；用无菌吸管轻轻插入到单个核细胞层，沿着管壁吸取该层，放入另一已预先盛有10-20mlPBS的试管中；将所获得的单个核细胞在室温下1500r/min离心10_20min，弃上清，重复洗涤1-2次，除去血小板、分离介质和抗凝物质；加入IMDM完全培养基重悬细胞，并计数细胞；置于37°C,5 %二氧化碳培养箱内； B、传代: 将在IMDM完全培养基中的悬浮细胞，培养于培养皿，首先用细胞计数板计数细胞，当细胞数翻倍时，进行传代；在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,弃上清，加入IMDM完全培养基，重悬细胞，吹打均匀后依次转移入培养皿；` C、冻存和复苏 冻存:冻存前24小时更换新鲜的IMDM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，无菌条件下，吸除培养皿内培养基，转移入无菌离心管，1500r/min,离心5_10分钟，弃上清，加入含頂DM完全培养基，调整细胞浓度为I X IO6~2 X 106/ml，分装细胞悬液至EP管，每管为Iml细胞悬液，大约I X IO6~2 X IO6个细胞数，再次离心，1500r/min,离心5-10分钟，弃上清，细胞沉淀加入l_3ml冻存液，吹打均匀，移入无菌冻存管，4°C 30分钟，-200C 60分钟，_80°C过夜，次日移入液氮； 复苏:从液氮中取出冻存管，迅速置于37°C温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10_20min，弃去上清液，细胞沉淀加MDM完全培养基，吹打均匀至单细胞悬液，转移入培养皿，置37°C，5%C02,95%湿度的CO2培养箱中培养； 所述的MDM完全培养基的配方为:MDM培养基，20%胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素100ug/ml。
3.—种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在建立体外的人不典型慢性粒细胞性白血病动物模型中的应用。
4.一种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的早期诊断试剂或试剂盒中的应用。
5.—种如权利要求1所述的人不典型慢性粒细胞性白血病细胞株NT-1在制备人不典型慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。
【文档编号】C12Q1/02GK103667192SQ201310596183
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】刘红, 钱娟, 刘杰 申请人:南通大学附属医院