一种褐飞虱细胞的原代培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种褐飞虱细胞的原代培养方法，该方法首先获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎，然后配制褐飞虱细胞培养基，采用机械法结合消化法分离褐飞虱胚胎的组织和细胞，最后进行褐飞虱胚胎细胞的原代培养；本发明是对半翅目昆虫细胞培养的重要补充；褐飞虱为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究褐飞虱，为其防治途径的研究和开发提供帮助。
【专利说明】一种褐飞虱细胞的原代培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及属于昆虫细胞培养【技术领域】，尤其涉及一种褐飞虱细胞的体外培养方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的迅猛发展，在生物工程【技术领域】中，细胞工程已愈来愈受到重视。从某种意义上说，基因工程是现代生物技术的核心，而细胞工程是现代生物技术的基础和公用平台。自从Grace在1962年首次建立天蚕蛾细胞系以来，昆虫细胞培养技术得到了迅速发展，400多株昆虫细胞系得以建立，这包括常用的黑腹果蝇
ter) S2 细胞系、粉纹夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)细胞系和草地贪夜蛾(5?o￡/o/7i6?ra /r^§7>6?r￡/a)Sf21细胞系及其克隆株Sf9。昆虫细胞系的建立，不但促进了昆虫生物学方面的基础研究，也大大促进了基于昆虫细胞的应用性研究。其中，昆虫细胞-杆状病毒表达系统(BEVS)是当今最具高效的真核表达系统，已广泛应用于β_干扰素等外源基因的表达。但是，现在已建立起的昆虫细胞系多来源于鳞翅目昆虫，来源于半翅目昆虫的细胞系为数不多，目前只有玻璃叶蝶(//OffiaTrOiZi1Sca coagulata)热灰飞M人LaodeIphax有细胞系建成的报道,这极大地限制了半翅目昆虫相关生物学的研究及其应用。
[0003]褐飞風(brownplanthopper, BPH, Nilaparvata lugens (Stil))属于半翅目昆虫，是亚洲稻区的主要害虫之一。它主要通过吸食水稻韧皮部汁液、传播水稻病毒两种方式对水稻造成危害。褐飞虱的大面积暴发会引起水稻叶片干枯，分蘖枯萎，甚至形成“虱烧”。褐飞虱有很强的适应能力，能快速适应不利环境(如水稻抗性品种和杀虫剂)，其致害性能快速变异，这可能与褐飞虱体内存在大量的共生菌有关。虽然通过高温或添加抗生素等方式可以获得少菌的褐飞虱种群，但是由于这两种方式对褐飞虱本身就有一定的副作用，因而在活体条件下难以研究褐飞虱和其共生菌的关系。而若有离体培养的褐飞虱细胞，则可以在离体条件下研究褐飞虱和其共生菌的互作，从而有助于阐明褐飞虱的致害性机制。另一方面，若有离体培养的褐飞虱细胞，也可以通过在细胞水平研究杀虫剂对褐飞虱的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。但目前，关于褐飞虱细胞的体外培养技术，还未见报道。因此，建立起一种褐飞虱细胞的离体培养方法，有助于褐飞虱防治工作的开展，并最终有利于粮食的安全生产，这具有重要的社会和经济效益。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种褐飞虱细胞的原代培养方法。
[0005]本发明目的是通过以下技术方案得以实现的。
[0006]一种褐飞虱细胞的原代培养方法，按以下步骤进行:
(O获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎:褐飞虱雌成虫和雄成虫配对后放入装有水稻(ASD7水稻)叶鞘的试管中，使它们在280C条件下(白天黑夜时间比为L: D=16h: 8h)产卵，在第二天的同一时间从叶鞘中剥出褐飞虱所产的卵，此卵定义为I天卵，依次获得褐飞虱的3天卵和4天卵；在解剖镜下，3天卵可看到明显的黄斑，而4天卵可观察到眼点；此3天卵或4天卵的发育时期处于反转期前后，适合于后续的胚胎细胞培养。
[0007](2)褐飞虱细胞培养基的配制:本发明所述的褐飞虱细胞培养基的配制方法:分别称取 Schneider，s insect medium (SIGMA, S9895) 12.25g, Medium 199 (Applichem,A1327,9010) 5.35g ；Medium CMRL 1066 (IX) (Gibco，11530-037) 25mL ;L_His.HCI.H2O(SIGMA, H5659) 2.36g ；L-His (SIGMA, H6034) 2.135g ;胎牛血清(Hyclone，SV30087.02)149mL-248mL ；CaCl2 (分析纯)0.3g ；NaHCO3 (分析纯)0.2g ;氨苄青霉素钠(上海生工，A0339)62mg ;硫酸链霉素(上海生工，S0382) 62mg ;上述各成分混合，用超纯水充分溶解后，用2MNaOH或HCl溶液调节pH至6.5-6.6，而后用超纯水定容至1240 mL,经0.22 μ m微孔滤膜过滤后置于4°C备用；过滤过程采用无菌操作，胎牛血清的体积终浓度为12%-20%。
[0008](3)机械法结合消化法分离褐飞虱胚胎的组织和细胞:取100粒褐飞虱3天卵或4天卵，用体积百分比为75%酒精表面消毒5-10分钟，接着用无菌的IX PBS (磷酸盐缓冲液，pH = 7.2)漂洗3遍，而后把卵转移到小细胞培养皿(直径35 mm)中，加入100 μ L的无菌IX PBS (pH = 7.2)，用无菌的弯尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中。用无菌的ImL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，800-1000转/分钟离心5-10分钟，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀。用100 μ L质量体积比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(含或不含EDTA)悬浮胚胎组织，37°C条件下消化1-5分钟；往胰蛋白酶溶液加入一倍体积以上的步骤2配置的褐飞虱细胞培养基终止胰蛋白酶消化，800-1000转/分钟离心5-10分钟，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀。整个过程采用无菌操作。
[0009](4)褐飞虱胚胎细胞的原代培养:用褐飞虱细胞培养基1200 μ L悬浮上述褐飞虱胚胎组织和细胞沉淀，将其转移到小细胞培养皿(直径35mm)或6孔细胞培养板中，用Paraf ilm封口膜包好后放置于27°C恒温培养箱中培养。第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜褐飞虱细胞培养基，并视贴壁细胞生长情况，每隔5-8天更换一次褐飞虱细胞培养基。I个月后，即可以得到贴壁生长的褐飞虱细胞群。整个过程采用无菌操作。
[0010]本发明的有益效果是:现有的昆虫细胞培养多局限于鳞翅目昆虫，而半翅目昆虫细胞的培养只是其中的一小部分，本发明是对半翅目昆虫细胞培养的重要补充。褐飞虱为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究褐飞虱，为其防治途径的研究和开发提供帮助。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实例对本发明作进一步的详细说明: 实施例1:取100粒褐飞虱3天卵，用75%酒精表面消毒5分钟，之后用无菌的IX PBS(pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完毕后，把卵转移到小细胞培养皿(直径35 mm)中，加入100 μ L无菌IX PBS (pH = 7.2)，用无菌的弯尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中。用无菌的ImL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，以1000转/分钟的转速离心5分钟后，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀。用IOOyL质量体积比
0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(含0.02 % EDTA)悬浮胚胎组织，并在37度条件下消化2分钟。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基终止消化，之后，以1000转/分钟的转速离心5分钟后，小心用200 μ L枪头吸走上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀。用1200 μ L上述含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基悬浮胚胎组织和细胞沉淀，并转移至小细胞培养皿(直径35_)中。第2天，更换新鲜的褐飞虱细胞培养基。3天之后，在10倍物镜下每个视野平均可以观察到76个细胞团。每隔I周更换一次含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基。结果，I个月后，在10倍物镜视野下可见大量的贴壁细胞，细胞团重叠现象较多。
[0012]实施例2:取100粒褐飞虱3天卵，用75%酒精表面消毒10分钟，之后用无菌的IX PBS (pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完毕后，把卵转移到小细胞培养皿(直径35 mm)中，加入100 μ L无菌IX PBS (pH = 7.2)，用弯尖的眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中。用无菌的ImL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，以800转/分钟的转速离心10分钟后，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀。用100 μ L质量体积比
0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(不含EDTA)悬浮胚胎组织，并在37度条件下消化5分钟。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有12%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基终止消化，之后，以800转/分钟的转速离心10分钟后,小心用200 μ L枪头吸走上清液,获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀。用1200 μ L上述含有12%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基悬浮胚胎组织和细胞沉淀，并转移至小细胞培养皿(直径35mm)中。第2天，更换新鲜培养基。3天之后，在10倍物镜下每个视野平均可以观察到56个细胞团。每隔6天更换一次含有12%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基。结果，I个月后，在10倍物镜视野下也可见大量的贴壁细胞，但细胞团重叠的情况与实施例1相比少了约一半。
[0013]实施例3:取100粒褐飞虱产后4天卵，用75%酒精表面消毒10分钟，之后用无菌的IX PBS (pH = 7.2)漂洗3遍。表面消毒完毕后，把卵转移到小细胞培养皿(直径35mm)中，加入100 μ L无菌IX PBS (pH = 7.2)，用无菌的弯尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中。用无菌的ImL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，以1000转/分钟的转速离心5分钟后，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀。用IOOyL质量体积比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液(不含EDTA)悬浮胚胎组织，并在37度条件下消化I分钟。消化后，往消化液中加入100 μ L的含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基终止消化，之后，以1000转/分钟的转速离心5分钟后，小心用200 μ L枪头吸走上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀。用1200 μ L上述`含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基悬浮胚胎组织和细胞沉淀，并转移至小细胞培养皿(直径35mm)中。第2天，更换新鲜培养基。3天之后，在10倍物镜下每个视野平均可以观察到34个细胞团，但细胞团相教实施例1和实施例2的细胞团要大。每隔8天更换一次含有20%胎牛血清的褐飞虱细胞培养基。结果，I个月后，在10倍物镜视野下也可见大量的贴壁细胞，但细胞团之间的重叠情况较少。
[0014]上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种褐飞虱细胞的原代培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (O获取发育时间在3天到4天的褐飞虱胚胎:褐飞虱雌成虫和雄成虫配对后放入装有水稻叶鞘的试管中，使它们在28°C条件下产卵；在第二天的同一时间从叶鞘中剥出褐飞虱所产的卵，定义为I天卵；依次获得褐飞虱的3天卵和4天卵；在解剖镜下，3天卵可看到明显的黄斑，而4天卵可观察到眼点；此3天卵或4天卵的发育时期处于反转期前后，适合于后续的胚胎细胞培养； (2)褐飞風细胞培养基的配制:分别称取12.25g的Schneider’ s insect medium、.5.35g 的 Medium 199、25mL 的 Medium CMRL 1066 (IX ),2.36g 的 L-His.HCl.Η20、2.135g的 L-His、149mL-248mL 胎牛血清、0.30g 的 CaCl2、0.20g 的 NaHC03、62mg 的氨苄青霉素钠、62mg的硫酸链霉素等成分；上述各成分混合,加入超纯水至1000 mL使上述成分充分溶解，再用2M NaOH或HCl溶液调节pH至6.5-6.6，而后用超纯水定容至1240 mL，经0.22μπι微孔滤膜过滤后置于4°C备用；过滤过程采用无菌操作； (3)机械法结合消化法分离褐飞虱胚胎的组织和细胞:取约100粒褐飞虱3天卵或4天卵，用体积百分比约为75%的酒精表面消毒5-10分钟，接着用无菌的IX PBS漂洗3遍，而后把卵转移到小细胞培养皿中，加入100 μ L的无菌IX PBS，用无菌的弯尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎组织裸露到PBS中；用无菌的ImL枪头把含有胚胎组织的PBS吸到1.5 mL的无菌离心管中，800-1000转/分钟离心5-10分钟，去除上部PBS，获得胚胎组织沉淀；用.100 μ L质量体积比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液悬浮胚胎组织，37°C条件下消化1_5分钟；往胰蛋白酶溶液加入一倍体积以上的步骤2配置的褐飞虱细胞培养基终止胰蛋白酶消化，800-1000转/分钟离心5-10分钟，去除上清液，获得消化后的胚胎组织和细胞沉淀；整个过程采用无菌操作； (4)褐飞虱胚胎细胞的原代培养:用褐飞虱细胞培养基1200μ L悬浮上述褐飞虱胚胎组织和细胞沉淀，将其转移到小细胞培养皿或6孔细胞培养板中，用ParafiIm封口膜包好后放置于27°C恒温培养箱中培养；第2天，待组织和细胞贴壁后，更换新鲜褐飞虱细胞培养基，并视贴壁细胞生长情况，每隔5-8天更换一次褐飞虱细胞培养基；I个月后，即可以得到贴壁生长的褐飞虱细胞群；整个过程采用无菌操作。
【文档编号】C12N5/07GK103667173SQ201310608825
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】许益鹏, 俞晓平, 申屠旭萍, 郝培应 申请人:中国计量学院