一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法
【专利摘要】本发明公开一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，该方法通过以下工艺步骤：(1)多重结晶；(2)活化；(3)盐析；(4)超滤；(5)热原处理；(6)透析；(7)亲和层析；(8)冻干，制备糜蛋白酶。本发明对糜蛋白酶的生产工艺进行不断改进，特别是对各工艺参数进行反复的实验研究，不断优化，最终确立了一套更为科学的规模化生产工艺，经亲和层析纯化所得的糜蛋白酶的效价高达1500～1800iu／mg，并且各项指标均符合中国药典规定。
【专利说明】一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体地说涉及一种应用多重结晶、活化、盐析、透析、亲和层析等纯化糜蛋白酶的方法。
【背景技术】
[0002]糜蛋白酶又称胰凝乳蛋白酶，分子量为42000道尔顿，用于肽链的酶解，专门水解肽键，属于肽链内切酶，水解产率很高，但其专一性小于胰蛋白酶。其固体状态较稳定，呈白色棒状结晶；而水溶液极不稳定，pH在5~8时，其活力最强，也最易失去活性。
[0003]糜蛋白酶为胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质，作用、用途与胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力强、毒性低、不良反应小。一般用于手术后创口或创伤愈合、抗炎及防止局部积血、水肿、扭伤血肿、乳房手术后局部肿胀、鼻炎、中耳炎等。也可用于白内障摘除、松解睫状肌韧带，以减少膜破裂和视网膜损伤。此外，糜蛋白酶与胰蛋白酶或其他化学药剂共同治疗各种炎症具有协同作用，故常用于外科创伤及眼睛消肿治疗。
[0004]本发明人自2008年开始对糜蛋白酶的生产工艺进行试验研究，特别是在生产过程中，不断探索，通过改变条件的多重结晶，使糜蛋白酶效价高达1500~1800iu / mg,生产工艺稳定，质量可控。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，是为了解决糜蛋白酶提取工艺蛋白活性损失严重的缺点，通过改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析纯化糜蛋白酶，较好的保持蛋白活性。
[0006]为解决上述技术问 题，本发明采用以下技术方案予以实现:
[0007]—种亲和层析纯化糜蛋白酶的方法，其特征在于:改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术，将糜蛋白酶效价提高到1500~ISOOiu /mg，更好的保持了蛋白的活性。在发明技术方案中，其特征还在于所述提取工艺包括如下步骤:
[0008]I)多重结晶
[0009]1.1)结晶 I
[0010]核对糜蛋白酶原重量，加糜蛋白酶原重量7倍(w / V)纯化水搅拌溶解，加入少许硫酸搅拌，调节pH值至2.5~3.5 ;按2倍糜蛋白酶原重量(w / V)加入饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5~5.5，置于25°C条件下，保温，过滤，收集滤饼；
[0011]1.2)结晶 II
[0012]加滤饼重量3倍量(w / V)的纯化水溶解，调节pH值至2.5~3.5 ;加滤饼重量I倍量(w / V)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5~5.5，置于25°C条件下，保温，过滤，收集滤饼；
[0013]1.3)结晶 III[0014]加滤饼重量3倍量(w / V)的纯化水溶解，调节pH值至2.5~3.5 ;加滤饼重量I倍量(w / V)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5~5.5，置于25°C条件下，保温，过滤，收集滤饼，滤液作母液回收；
[0015]1.4)母液回收 III
[0016]量取母液体积，调节pH值至2.5~3.5，按硫酸铵:母液=305g:1L的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解；
[0017]1.5)结晶 IV
[0018]加滤饼重量3倍量(w / V)的纯化水溶解，调节pH值至2.5~3.5 ;加滤饼重量I倍量(w / V)饱和硫酸铵溶液，搅拌，调节pH值至4.5~5.5，置于25°C条件下，保温，过滤，收集滤饼，滤液作母液回收；
[0019]1.6)母液回收IV
[0020]量取母液体积，调节pH值至2.5~3.5，按硫酸铵:母液=305g:1L的比例，加入固体硫酸铵，搅拌溶解；
[0021]2)活化
[0022]称量滤饼重量，加3倍量纯化水溶解，调节pH值至7.0~9.0 ;加入滤饼重量I倍量的(w / V)磷酸缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0~9.0。加入胰蛋白酶活化，置于冰箱中，两天后调节PH值至7.0~9.0 ;
[0023]3)盐析
[0024]活化液调节pH值至3.0~5.0，加入固体硫酸铵，静置过夜，次日过滤，收集滤饼；
[0025]4)超滤
[0026]加入滤饼重量15倍量的(w / V)磷酸盐缓冲液，搅拌，调节pH值至7.0~9.0，待液体超滤，体积控制在3 / 10 ;
[0027]5)热原处理
[0028]5.1)取超滤液，按50:5:3的比例，先后加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液；
[0029]5.2)调节pH值至8.0~10.0,搅拌,离心,弃去沉淀物,取滤液,准备透析扎包；
[0030]6)透析工序
[0031 ] 取滤液，透析液扎包，放入纯化水中，进行透析交换，透析4~6天；
[0032]7)亲和层析
[0033]7.1)用适量的含 0.5-3mol / L(NH4)2SO4 的 0.01-0.3mo I / L，PH3_8 的 NaAc-HAc缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0034]7.2)将透析液流经此柱，流速控制在I~5mL / min左右；
[0035]7.3)平衡后，用0.5-3mol / L的(NH4)2SO4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；
[0036]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡缓冲液洗脱，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，_20°C保存；
[0037]8)冻干
[0038]调节pH值至5.5~6.5，装盘、冻干，得糜蛋白酶。
[0039]经检测，所得糜蛋白酶效价约为1500~1800iu / mg。
[0040]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
[0041]选用改变条件的多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术纯化糜蛋白酶，可以使其理化性质和生物活性在后续生产过程中保持稳定，最终使糜蛋白酶的各项指标均符合中国药典标准。更重要的是，通过工艺的不断改进和完善，使得糜蛋白酶效价提高到1500~1800iu / mg,节约成本,提高了经济效益。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，而不以任何方式限制。
[0043]实施例1
[0044]1)多重结晶
[0045]1.1)结晶 I
[0046]将30kg糜蛋白酶原投入反应罐中，加入210L纯化水搅拌溶解，加2.5mol / L硫酸500mL搅拌8小时后，再用2.5mol / L硫酸调节pH值至2.5 ;加入饱和硫酸铵溶液60L，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至4.5，置于25°C条件下，恒温48小时后过滤，收集滤饼23.6kg ；
[0047]1.2)结晶 II
[0048]将所得滤饼投入反应罐中，加70.8L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.0;加23.6L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mo I / L NaOH调节pH值至5.0，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼20.5kg ；
[0049]1.3)结晶 III
[0050]将所得滤饼投入反应罐中，加61.5L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.5 ;加20.5L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至5.5，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼15.4kg，滤液作母液回收；
[0051]1.4)母液回收 III
[0052]量取母液体积84.3L，用2.5mol / L硫酸调节pH值至2.5，加入固体硫酸铵25.71kg,搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.4kg ；
[0053]1.5)结晶 IV
[0054]合并所得滤饼投入反应罐中，加53.4L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节PH值至2.5 ;加17.8L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至5.0，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼13.3kg，滤液作母液回收；
[0055]1.6)母液回收IV
[0056]量取母液体积71.9L，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.5，加入固体硫酸铵21.93kg,搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.1kg ；
[0057]2)活化
[0058]合并所得滤饼投入反应罐中，加46.2L纯化水溶解，加2.5mol / L硫酸助溶，用5mol / L NaOH调节pH值至7.0 ;加入15.4L磷酸缓冲液，搅拌10分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至7.5，得料液62.5L。加入胰蛋白酶晶体12.5g，置于4°C冰箱中，两天后用5mol /L NaOH调节pH值至8.0，得活化液59.2L ；
[0059]3)盐析
[0060]上述活化液用2.5mol / L硫酸调节pH值至4.0，加入固体硫酸铵29.6kg，静置过夜,次日过滤,收集滤饼12.4kg ；[0061]4)超滤
[0062]将所得滤饼投入反应罐中，加入磷酸盐缓冲液186L，搅拌10分钟，用5mol / LNaOH调节pH值至8.5，待液体超滤，体积控制在3 / 10，得超滤液188L ；
[0063]5)热原处理
[0064]5.1)取上述超滤液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol / L磷酸钠溶液18.8L，在不断搅拌下缓缓加入lmol / L醋酸钙溶液11.28L ；
[0065]5.2)用2mol / L NaOH调节pH值至9.0，稳定后继续搅拌1.5小时，结束后，离心20分钟，弃去沉淀物，得滤液180L ；
[0066]6)透析工序
[0067]取上述滤液，透析液扎包(IOOmL /包)，将透析袋放入4°C纯化水中，进行透析交换5天,每24小时换一次纯化水；
[0068]7)亲和层析
[0069]7.1)用 66L 的含 1.5mol / L(NH4)2SO4 的 0.2mol / L, PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0070]7.2)将透析液流经此柱，流速控制在3mL / min左右；
[0071]7.3)平衡后， 用1.5mol / L的(NH4)2SO4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；
[0072]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡缓冲液洗脱，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，_20°C保存；
[0073]8)冻干
[0074]用2mol / L NaOH溶液调节pH值至6.0，装盘、冻干，得糜蛋白酶9.3kg。
[0075]经检测，所得糜蛋白酶效价约为1666iu / mg。
[0076]实施例2
[0077]I)多重结晶
[0078]1.1)结晶 I
[0079]将28kg糜蛋白酶原投入反应罐中，加入196L纯化水搅拌溶解，加2.5mol / L硫酸500mL搅拌8小时后，再用2.5mol / L硫酸调节pH值至2.5 ;加入饱和硫酸铵溶液56L，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至4.5，置于25°C条件下，恒温48小时后过滤，收集滤饼23.2kg ；
[0080]1.2)结晶 II
[0081]将所得滤饼投入反应罐中，加69.6L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.0 ;加23.2L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至5.0，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼20.2kg ；
[0082]1.3)结晶 III
[0083]将所得滤饼投入反应罐中，加60.6L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.5 ;加20.2L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至
5.5,置于25°C条件下,恒温24小时后过滤,收集滤饼15.1kg,滤液作母液回收；
[0084]1.4)母液回收 III
[0085]量取母液体积81.6L，用2.5mol / L硫酸调节pH值至2.5，加入固体硫酸铵24.89kg,搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.3kg ；[0086]1.5)结晶 IV
[0087]将所得滤饼投入反应罐中，加52.2L纯化水搅拌溶解滤饼，用2.5mol / L硫酸调节pH值至2.5 ;加17.4L饱和硫酸铵溶液，搅拌15分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至
5.0，置于25°C条件下，恒温24小时后过滤，收集滤饼12.6kg，滤液作母液回收；
[0088]1.6)母液回收IV
[0089]量取母液体积70.1L，用2.5mol / L硫酸调节pH值至3.5，加入固体硫酸铵21.38kg,搅拌溶解，静置过夜，次日过滤，收集滤饼2.2kg ；
[0090]2)活化
[0091]将所得滤饼投入反应罐中，加44.4L纯化水溶解，加2.5mol / L硫酸助溶，用5mol / L NaOH调节pH值至7.0 ;加入14.8L磷酸缓冲液，搅拌10分钟，用5mol / L NaOH调节pH值至7.5，得料液60.5L。加入胰蛋白酶晶体12.lg，置于4°C冰箱中，两天后用5mol /L NaOH调节pH值至8.0，得活化液58.4L ；
[0092]3)盐析
[0093]上述活化液用2.5mol / L硫酸调节pH值至4.0，加入固体硫酸铵29.2kg，静置过夜,次日过滤,收集滤饼12.2kg ；
[0094]4)超滤
[0095]将所得滤饼投入反应罐中，加入磷酸盐缓冲液183L，搅拌10分钟，用5mol / LNaOH调节pH值至8.5，待液体超滤，体积控制在3 / 10，得超滤液185L ；
[0096]5)热原处理`
[0097]5.1)取上述超滤液，按50:5:3的比例，先加入0.4mol / L磷酸钠溶液18.5L，在不断搅拌下缓缓加入lmol / L醋酸钙溶液11.1L ;
[0098]5.2)用2mol / L NaOH调节pH值至9.0，稳定后继续搅拌1.5小时，结束后，离心20分钟，弃去沉淀物，得滤液17gL ；
[0099]6)透析工序
[0100]取上述滤液，透析液扎包(IOOmL /包)，将透析袋放入4°C纯化水中，进行透析交换5天,每24小时换一次纯化水；
[0101]7)亲和层析
[0102]7.1)用 60L 的含 2mol / L(NH4)2SO4 的 0.15mol / L，PH3_8 的 NaAc-HAc 缓冲液平衡亲和层析快胶柱；
[0103]7.2)将透析液流经此柱，流速控制在2mL / min左右；
[0104]7.3)平衡后，用lmol / L的(NH4)2SO4溶液洗脱至蛋白检测仪显示至基线；
[0105]7.4)再用不含(NH4) 2S04平衡缓冲液洗脱，收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，_20°C保存；
[0106]8)冻干
[0107]用2mol / L NaOH溶液调节pH值至6.5，装盘、冻干，得糜蛋白酶8.8kg。
[0108]经检测，所得糜蛋白酶效价约为1734iu / mg ο
[0109]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变 化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种亲和层析分段洗脱纯化糜蛋白酶的方法，该方法包括:通过改变结晶条件进行多重结晶，结合超滤、透析、亲和层析等现代生物分离技术，提高了纯化糜蛋白酶的效率，保持糜蛋白酶的效价稳定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:以糜蛋白酶原为原料，依次经过多重结晶、活化、盐析、超滤、热原处理、透析、亲和层析、冻干等工序纯化得到糜蛋白酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述纯化工艺包括如下步骤: . 1)糜蛋白酶原溶解后，加入饱和硫酸铵溶液，过滤，收集滤饼；溶解滤饼，结晶，母液回收，收集滤饼；改变结晶条件，重复结晶3次； . 2)溶解滤饼，加磷酸盐缓冲液，加入活化剂活化； . 3)活化液调节pH值后加入固体硫酸铵进行盐析，静置过夜，过滤，收集滤饼； . 4)加入磷酸盐缓冲液搅拌调节pH值，超滤； . 5)超滤液加入磷酸钠溶液和醋酸钙溶液后，调节pH搅拌，离心，弃沉淀物； . 6)取上述滤液置于于透析袋中，透析4~6天； . 7)亲和层析，用2种洗脱液进行洗脱，最终收集含糜蛋白酶活性峰的洗脱液，-20°C保存； . 8)调节pH值，装盘、冻干，得糜蛋白酶。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，为了减少蛋白活性的损失，溶解糜蛋白酶原和透析最好选用冰冷的纯化水，4°C效果最佳。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，改变条件多次结晶，尤其是母液回收的工艺优化，提高了纯化糜蛋白酶的效率，更好的保持了蛋白的活性。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于多重结晶中还应进行必要的母液回收，并且硫酸铵:母液=305g:1L，活化工序中每IOOmL待活化液中加入胰蛋白酶5mg，盐析工序中每升活化液中加入500g硫酸铵。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析快胶柱包括:苯基-Sepharose2B FF,苯基 _Sepharose4B FF,苯基 _Sepharose6B FF,苯基-SepharoseCL-2B FF，苯基-Sepharose CL-4B FF，苯基-Sepharose CL-6B FF。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述亲和层析条件为:平衡液选用含.0.5-3mol / L(NH4)2SO4 的 0.01-0.3mol / L，PH3-8 的 NaAc-HAc 缓冲液，流速控制在 I ~.5mL / min左右，洗脱液选用0.5-3mol / L的(NH4) 2S04溶液和不含(NH4) 2S04平衡缓冲液。
9.如权利要求1~7所述的方法，其特征在于:亲和层析纯化所得糜蛋白酶效价高达.1500 ~1800iu / mgο
【文档编号】C12N9/76GK103667226SQ201310613306
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月23日 优先权日:2013年11月23日
【发明者】刘乃山, 林晓磊, 葛翠凤, 刘翠珍 申请人:青岛康原药业有限公司