一种分离提取糜蛋白酶的方法
【专利摘要】本发明阐述一种分离提取糜蛋白酶的方法。该制备方法包括以下工艺步骤：(1)结晶；(2)活化；(3)盐析；(4)透析；(5)冻干。本发明建立起一套规模化的生产工艺，具有简单、低成本等优点，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。
【专利说明】一种分离提取糜蛋白酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域，设计药用糜蛋白酶的生化分离技术。具体地说是采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶。
【背景技术】
[0002]糜蛋白酶是从牛胰腺或猪胰腺中分离纯化得到的一种蛋白酶。它在药理和临床上的功用主要有两方面:一、消炎:对各种炎症、炎性水肿、血肿、溃疡及血栓等有较好疗效。二、抗癌:能促进抗癌药物向病灶渗透，促使化疗药物发挥作用，局部大剂量使用时作用更强。大剂量使用可治疗多种肿瘤，如乳腺癌、宫颈癌、胃癌等，并且无任何毒副作用或不良反应。
[0003]中国专利CN1944641A公开了一种分离提取糜蛋白酶的方法，采用亲和层析工艺从糜蛋白酶原生产高纯度糜蛋白酶，但是正如中国专利CN1013025B分析，也存在一些缺点，最主要的，亲和层析介质昂贵，可重复使用次数少，介质的使用量大，不适合规模化大生产。而中国专利CN1013025B虽然解决了亲和层析的不足，也能获得高比活的糜蛋白酶，但同样，比较起传统工艺来，生产成本太高。可是随着糜蛋白酶的应用广泛，使得国际市场对本产品的需求不断扩大，质量要求上也更加严格，要求产品有更高的质量:《中国药典》(2010版)规定，糜蛋白酶的效价不得少于1000单位/毫克。针对效价提高的要求，本发明对传统工艺进行了改进和创新。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了生产高质量的糜蛋白酶而又降低生产成本，对传统工艺加以改造，尤其是参数的改造，提供了一种分离提取糜蛋白酶的方法，该方法包括如下步骤:
[0005](I)结晶工序
[0006]投料:取糜蛋白酶粗品，按5~9ml/g的比例加水溶解，调pH值至2.5~3.5，搅拌8~10小时后，静置12~16小时。
[0007]结晶I
[0008]静置结束后搅拌，并调pH值至2.0~3.0。按I~3ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，搅拌10~30分钟，调pH值至4.5~5.5，置20~28°C条件下，保温40~48小时，过滤，收集滤饼，滤液弃去。
[0009]结晶II
[0010]按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5~5.5，置20~28°C条件下，保温20~24小时,过滤,收集滤饼。
[0011]结晶III
[0012]按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼,调pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5~5.5，置20~28°C条件下，保温20~24小时,过滤,收集滤饼。
[0013]结晶IV
[0014]按2~4ml/g的比例加入水溶解滤饼，调pH值至2.0~3.0，再按0.5~2.0ml/g的比例加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.5~5.5，置20~28°C条件下，保温20~24小时,过滤,收集滤饼。
[0015]⑵活化工序
[0016]称量滤饼重量，按2~4ml/g的比例加入水溶解，调pH值至7.0~8.5。
[0017]再按0.5~1.5ml/g滤饼的比例加入磷酸盐缓冲液,搅拌,调节pH值至7.0~8.5。加入活化剂胰蛋白酶，比例为3~8mg/100ml料液，活化60~80小时。
[0018]⑶盐析工序
[0019]活化结束后调pH值至3.0~5.0,量取活化液体积，按400~600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析，放置12~16小时。
[0020]过滤，弃滤液，收集滤饼。
[0021](4)透析工序
[0022]滤饼按I~1.5ml/g的比例加入水，搅拌溶解，透析4~6天。
[0023](5)冻干工序
[0024]收集、合并透析液，过滤，量取体积，调pH值至5.5~6.7，装盘、冻干。
[0025]与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:
[0026]本发明采用盐析、多重结晶结合透析等技术来提取糜蛋白酶，通过对传统工艺的改进和创新，不仅生产出了高质量的糜蛋白酶，同时又具有简单、低成本等优点。
[0027]本发明已建立起一套规模化的生产工艺，制备的糜蛋白酶精品效价高达1200单位/毫克以上，符合《中国药典》(2010版)要求，具有极大的市场竞争力。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0029]实施例1
[0030](I)结晶工序
[0031]投料:取糜蛋白酶粗品20.0gJP 100ml纯化水溶解，并加适量2.5mol/L H2S04溶液调节PH2.6，搅拌8小时后，静置12小时。
[0032]结晶I
[0033]静置结束后搅拌，并加2.5mol/L H2S04溶液调ρΗ2.I。加入饱和硫酸铵溶液20ml，搅拌10分钟，用5mol/L NaOH调pH4.6，置20°C条件下，保温40小时，过滤，收集滤饼，称重37.6g,滤液弃去。
[0034]结晶II
[0035]滤饼加76ml纯化水溶解，用2.5mol/l硫酸调pH2.0,加饱和硫酸铵溶液18.8ml,用5mol/L NaOH调pH4.5，置20°C条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重33.lg。
[0036]结晶III
[0037]滤饼加66.2ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH2.0，加饱和硫酸铵溶液16.6ml,用5mol/L NaOH`调pH4.5，置20°C条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重30.7g。
[0038]结晶IV
[0039]滤饼加61.4ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH2.0，加饱和硫酸铵溶液15.4ml,用5mol/L NaOH调pH4.5，置20°C条件下，保温20小时，过滤，收集滤饼，称重30.4g0
[0040](2)活化工序
[0041]加60.8ml纯化水溶解滤饼，加5mol/L NaOH溶液调ρΗ7.2。
[0042]加入磷酸盐缓冲液15.2ml，搅拌片刻，调ρΗ7.2。加入活化剂胰蛋白酶0.5mg,活化60小时。
[0043](3)盐析工序
[0044]用2.5mol/L硫酸调pH3.1，量取活化液体积155ml，加入固体硫酸铵62g进行盐析，放置12小时，过滤，弃滤液，收集滤饼，称重32g。
[0045](4)透析
[0046]滤 饼加入纯化水32ml，搅拌溶解，透析4天。
[0047](5)冻干工序
[0048]收集、合并透析液，过滤，量取体积153ml,调节pH5.6,装盘I盘、冻干,称重7.7g。
[0049](6)根据《中国药典》(2010版)规定的糜蛋白酶效价检测法对本品进行检验，本品的效价为1485单位/毫克。
[0050]实施例2
[0051](I)结晶工序
[0052]投料:取糜蛋白酶粗品20.3g，加180ml纯化水溶解，并加适量2.5mol/L H2S04溶液调节PH3.2，搅拌10小时后，静置15小时。
[0053]结晶I
[0054]静置结束后搅拌，并加2.5mol/L H2S04溶液调ρΗ2.8。加入饱和硫酸铵溶液60ml，搅拌30分钟，用5mol/L NaOH调pH5.4，置28°C条件下，保温48小时，过滤，收集滤饼，称重37.9g,滤液弃去。
[0055]结晶II
[0056]滤饼加151ml纯化水溶解，用2.5mol/l硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液75.8ml，用5mol/L NaOH调ρΗ5.3，置26°C条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重33.3g。
[0057]结晶III
[0058]滤饼加133.2ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液66.6ml,用5mol/L NaOH调pH5.3，置26 V条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重30.8g0
[0059]结晶IV
[0060]滤饼加123.2ml纯化水溶解，用2.5mol/L硫酸调pH3.0，加饱和硫酸铵溶液41.6ml,用5mol/L NaOH调pH5.3，置26 V条件下，保温24小时，过滤，收集滤饼，称重30.6g0
[0061](2)活化工序
[0062]加122.4ml纯化水溶解滤饼，加5mol/L NaOH溶液调pH8.4。[0063]加入磷酸盐缓冲液61.2ml，搅拌片刻，调pH8.4。加入活化剂胰蛋白酶4.8mg,活化80小时。
[0064](3)盐析工序
[0065]用2.5mol/L硫酸调pH4.8，量取活化液体积159ml，加入固体硫酸铵79g进行盐析，放置16小时，过滤，弃滤液，收集滤饼，称重33g。
[0066](4)透析
[0067]滤饼加入纯化水49.5ml，搅拌溶解，透析6天。
[0068](5)冻干工序
[0069]收集、合并透析液，过滤，量取体积155ml,调节pH6.6,装盘I盘、冻干,称重7.8g。
[0070](6)根据《中国药典》(2010版)规定的糜蛋白酶效价检测法对本品进行检验，本品的效价为1378单位/毫克。
[0071]以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
【权利要求】
1.一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)结晶；(2)活化；(3)盐析；(4)透析；(5)冻干。
2.权利要求1所述制备方法，其特征在于，各步骤具体为: (1)结晶工序 糜蛋白酶粗品加水溶解，调PH值至2.5~3.5，静置8~12小时；结晶:将糜蛋白酶粗品溶解液再调PH值至2.0~3.0 ;加入饱和硫酸铵溶液，调pH值至4.0~6.0,置25±3°C条件下，保温20~48小时，过滤，收集滤饼； 滤饼加水溶解，重复上述结晶操作3次，收集滤饼； (2)活化工序 用水溶解上步中所得滤饼，调pH值至7.0~9.0 ; 加磷酸盐缓冲液，调PH值至7.0~9.0 ;加入活化剂，活化60~80小时； (3)盐析工序 活化液调pH值至3.0~5.0，加入固体硫酸铵进行盐析，过滤，收集滤饼； (4)透析工序 滤饼加水溶解，放透析袋，透析4~6天。 (5)冻干工序` 收集、合并透析液，过滤，调节pH值至5.5~6.7,装盘、冻干。
3.根据权利要求2所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，饱和硫酸铵溶液与粗品溶液的体积比为I~3。
4.根据权利要求2所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入活化剂的比例为3~8mg/100ml料液，活化60~80小时。
5.根据权利要求4所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述活化剂为膜蛋白酶。
6.根据权利要求2所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(3)中活化液按400~600g/L的比例加入固体硫酸铵进行盐析。
7.根据权利要求2所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，滤饼加水溶解的比例为I~1.5ml/g。
8.根据权利要求2所述的一种分离提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步骤(5)中冻干前PH调节为6.0~6.5。
9.一种糜蛋白酶，其特征在于，所述糜蛋白酶通过权利要求1-8任意之一的方法制备得到，其效价为1200~1500单位/毫克。
【文档编号】C12N9/76GK103725667SQ201310638707
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】刘乃山, 李静洁, 安迪, 刘君 申请人:青岛康原药业有限公司