一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒。可直接用于国内11种已知稀有缺失型地中海贫血进行快速、稳定的检测。本发明的用于检测稀有缺失型地中海贫血的引物组，包括引物组A和引物组B；所述引物组A包括检测α-地贫缺失基因型的12条引物，所述引物组B包括检测β-地贫缺失基因型的10条引物。本发明试剂盒可采用多重Gap-PCR技术对11种稀有缺失基因型进行检测，可以直接一次检测多达11种稀有缺失地贫基因型，较在产前诊断利用巢式PCR结合遗传分析操作简单、省时、节约成本，为更全面的进行地贫筛查创造条件，为婚前、产前检测和孕期胎儿的地中海贫血诊断提供科学的依据。
【专利说明】一种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及ー种检测稀有缺失型地中海贫血的引物组和试剂盒。
【背景技术】
[0002]地贫是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。
[0003]a -地中海贫血(Thalassemia，以下简称a -地贫)，是ー组因a -珠蛋白链合成減少或不能合成，a-链/非a-链比例失衡为特征的遗传溶血性血红蛋白病。我国最常见的缺失类型为-03.7、-04.2、-SEA3种，随着a-地中海贫血机制的进ー步阐明，一些新的基因缺失类型相继被发现，例一11.1、-FIL、一THA1、- a 27.6、- a 2.4、- a 2.8，--11.1 -FIL, -THAI 均是缺失了两个a基因，当与--SEA结合时可产生一定量的HbBarts，而-a27.6、-a2.4、-a2.8均是缺失了ー个a基因，当这些基因型结合--SEA时，会引起Hb H病，这些新缺失类型的发现说明我国a-地贫有较广的基因谱，对目前地贫基因缺陷的筛查有重要的补充作用，提醒我们要避免异常基因型的漏检。
[0004]β-地中海贫血(简称0 -地贫)是位于11号染色体末端llpl5.3位点上的人 β- 珠蛋白基因(HBB)的先天性遗传缺陷。β-缺陷的后果是珠蛋白肽链合成減少或缺如，
导致Hb生成障碍，而产生溶血性贫血。β-地贫主要是因点突变(或少数几个核苷酸的插入或缺失)使β-珠蛋白肽链合成障碍(減少或缺如)所致。此外，由于β-珠蛋白基因簇的大片段缺失而导致的遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence offetal hemoglobin, HPFH)和δβ-地中海贫血(简称δβ-地贫)在中国人群中也占有相当的比例，其共同特征是基因发育阶段特异性表达失控而使出生后胎儿血红蛋白(fetalhemoglobin, HbF)持续增高,是ー组遗传异质性很大的血红蛋白病。
[0005]目前世界上在不同种族中已报道了至少40种此类因P -珠蛋白基因簇的大段缺
失而引起的血红蛋白病，中国人群中最常见的类型是βChinese(AYδβ)0(中国型)、βSEAβ0 (东南亚型，SEA)、βThai(AYδβ)0 (泰国型)，另外 βTunnanese(AYδβ)0(云南型)、βCatonese(AYδβ)0(广东型)、βTaiwanese(AYδβ)0(台湾型)也有报道。缺失型β -地贫杂合子与β -地贫点突变杂合子婚配后，有生育缺失突变复合β -地贫点突变患儿的风险，此类双重杂合子患儿多表现为中间型或重症β -地贫，也是需要重点预防的类型。缺失型β -地贫具有特异的表型，在临床上较易被发现，但目前暂时没有相关的基因检测试剂盒上市，给产前诊断带来一定困难，因此，开展并推广缺失型β -地贫的表型筛查和基因诊断技术，有助于我国β -地贫高发区产如诊断水平的进一步提尚。
[0006]目前，地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展稀有缺失型地贫的检测，提早发现地贫异常基因的携帯者，对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。
[0007]1、现有地贫检测技术简介:
[0008](1) Southern印迹杂交-限制性酶谱分析法:曾是a -地贫基因诊断的主要方法，但由于操作繁琐，所需时间较长，一般只适合研究使用，不适于临床的推广应用；(2)RFLP (限制性片段长度多态性)连锁分析:其先决条件是在该家庭中至少有ー个患儿或一个正常儿，以前是P地贫产前诊断最常用的方法，限制性片段长度的差异反应了各种基因型的差异，是ー种间接测试法，对部分家系不能诊断，且操作比较繁琐；(3)寡核苷酸探针技木:这ー技术可快速简便地检测已知突变的地贫基因，具有很高的灵敏性和准确性，但ー次杂交只能检测ー种突变，而且还需要同位素探针，难以推广应用；(4)依赖探针连接扩增技术(MLPA):MLPA能对所有的缺失基因型检测以及未知的基因型开展检测，具有闻效、特异的特点，常用于a、(6-地贫大片段缺失基因型的检测，但由于检测成本高，操作繁琐，耗时较长，检测流程长达16小时，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不便于分子筛查方法的推广应用；(5)测序技术:测序技术直接对DNA序列的分析，一直被认为是临床检测的金标准；目前测序技术面临着标本的处理(核酸提取)扩增标准化认证问题，信号检測、测序平台特异的出错和纠错问题，以及生物信息学方面可能出现的问题，临床验证程序和标准化问题等，一直没有有效的解决，因此还未能在临床中推广应用；(6)反向斑点杂交(Reverse Dot Blot, RDB)法:这ー方法具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点，目前已广泛应用于a、(6-地贫点突变的临床产前诊断和基因诊断。这种方法灵敏，但耗时较长，一般用于点突变检測；(7)实时荧光定量PCR (Taqman探针法):实时荧光定量PCR是目前临床诊断系统最受欢迎的检测平台。在地中海贫血检测中，报道的均只局限于ー种基因型的检测，工作量大，由于探针需要进行荧光标记，检测成本高；(8) Gap-PCR及其改进的技木:由于其易操作，此技术广泛用于缺失地贫的分子诊断，在缺失区域两端设计ー对引物，正常情况下两引物扩增 产物很长不属于扩增的范围，而出现缺失区域的时候能出现特异性的扩增。目前市场上以Gap-PCR开发的试剂盒只能检测中国最常见的3种缺型-a3.7、-a4.2和」'而不能检测一11_1、--^--1^1、-027_6、-02_4、-02_8等非常见的0-地贫缺失基因型
和 3 Chinese (A Y中国型)、^ SEABO (东南亚型，gEA ) > &5@)° (泰国型)、^ Y—…5
(云南型)、^TaiWaneSe0°(台湾型)等P -地贫缺失基因型。
[0009]2、现有产品及专利:
[0010]尽管检测地贫的方法和产品很多，但是目前尚未有直接、快速、同时检测多种稀有缺失型地贫的产品。本公司相关专利为《诊断a-地中海贫血的核酸膜条及试剂盒》(专利号为ZL200710074203.5)、《用于诊断P -地中海贫血的核酸杂交膜条及试剂盒》(专利号为ZL200510034015.0)和《a和0地中海贫血基因检测的核酸膜条及试剂盒》(专利号为ZL201210494748.2)，这些专利和本申请发明专利不属于同一个技术平台，与本申请发明专利相关的已经公开或者有权的专利相关统计对比如下，见表1。
[0011]表1与本申请专利相关的已经公开或者有权的部分专利
[0012]
【权利要求】
1.用于检测稀有缺失型地中海贫血的引物组，其特征在于，包括引物组A和引物组B; 所述引物组A包括检测a -地贫缺失基因型的12条引物，所述12条引物的序列分别如下:引物 A1:SEQ ID NO:1 ;引物 A2:SEQ ID NO:2 ;引物 A3:SEQ ID NO:3 ;引物 A4:SEQID NO:4 ;引物 A5:SEQ ID NO:5 ;引物 A6:SEQ ID NO:6 ;引物 A7:SEQ ID 勵:7;引物八8:SEQ ID NO:8 ;引物 A9:SEQ ID NO:9 ;引物 AlO:SEQ ID NO:10 ;引物 All:SEQ ID NO:11 ；引物 A12:SEQ ID NO:12 ； 所述引物组B包括检测P -地贫缺失基因型的10条引物，所述10条引物的序列分别如下:引物 B1:SEQ ID NO:13 ;引物 B2:SEQ ID NO:14 ;引物 B3:SEQ ID NO:15;引物 B4:SEQ ID NO:16 ;引物 B5:SEQ ID NO:17 ;引物 B6:SEQ ID NO:18 ;引物 B7:SEQ ID NO:19 ；引物 B8:SEQ ID NO:20 引物 B9:SEQ ID NO:21 ;引物 BlO:SEQ ID NO:22。
2.一种用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在干，包括PCR反应液A和PCR反应液B，所述PCR反应液A包含如权利要求1所述的引物组A，所述PCR反应液B包含如权利要求1所述的引物组B。
3.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液A还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液、PCR增强剂组合，所述PCR反应液B还包括dNTP、taq DNA聚合酶、Mg2+和PCR反应缓冲液、PCR增强剂，所述PCR增强剂组合包括5XQ Solution和Surfactin。
4.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液A各组分含量为:
5 X Q Solution:5 u L ；`
10XCoralLoad PCR Buffer:2.5 u L ；
2.5mM dNTP:2.0u L ；
25u M Surfactin:1.0 u L;
IOOii M 弓丨物 Al:0.051 u L ；
IOOiiM 弓丨物 A2:0.052u L ；
IOOiiM 弓丨物 A3:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A4:0.05u L ；
IOOiiM 弓丨物 A5:0.047 u L ；
IOOiiM 引物 A6:0.049 u L ；
IOOiiM 弓 I物 A7:0.035u L ；
IOOiiM 引物 A8:0.038u L ；
IOOiiM 引物 A9:0.04u L ；
IOOiiM 引物 AlO:0.037u L ；
IOOiiM 引物 All:0.05u L ；
IOOiiM 引物 A12:0.05u L ；
5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ； 去尚子水:9.451 u L0
5.根据权利要求2所述的用于检测稀有缺失型地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述的PCR反应液B各组分含量为:.5X Q Solution:5.0u L ;IOXCoralLoad PCR Buffer:2.5u L ；.2.5mM dNTP:2.0u L ；.25 u M Surfactin:1.0 u L;IOOiiM 弓丨物 BI:0.03u L ；IOOiiM 引物 B2:0.03u L ；IOOiiM 引物 B3:0.033u L ；IOOiiM 引物 B4:0.035u L ；IOOiiM 引物 B5:0.028u L ；IOOiiM 引物 B6:0.028u L ；IOOiiM 引物 B7:0.036u L ；IOOiiM 引物 B8:0.033u L ； IOOiiM 引物 B9:0.04u L ；IOOiiM 引物 BlO:0.043 u L ；.5U/u L Hotstar-Taq DNA polymerase:0.5 U L ；去尚子水:9.664 u L0
【文档编号】C12Q1/68GK103602752SQ201310656450
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】李印淑, 刘福平, 刘晶晶, 任维 申请人:亚能生物技术（深圳）有限公司