一种快速鉴定蔷薇属植物染色体数目的方法
【专利摘要】本发明提供一种快速鉴定蔷薇属植物染色体数目的方法，所述方法包括取材、预处理、固定、解离、染色、压片和镜检等步骤，其中，在压片步骤中，将压片过程数字化，以28至34N的力垂直敲击材料上的盖玻片160至200次为最好。在一些优选的实施方式中，所述方法采用茎尖和/或花芽作为染色体计数分析的材料。在一些优选的实施方式中，材料在上午9:00至11:00或者下午3:00至4:00获取。在一些实施方式中，所述方法采用电镜扫描确认材料的生长点及其位置。本发明的方法具有取材多样化、压片精确和快速准确高效等优点，特别适合于大批量蔷薇属植物染色体数目的快速而准确的鉴定。于大批量蔷薇属植物染色体数目的快速而准确的鉴定。
【专利说明】一种快速鉴定蔷薇属植物染色体数目的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鉴定植物尤其是蔷薇属植物的染色体数目的方法，属于植物细胞生物学和细胞遗传学领域。
技术背景
[0002]染色体是基因的载体，制备染色体标本是细胞遗传学的基础，优良的染色体制片技术，更是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。植物细胞染色体的观察和分析，对于染色核型分析、减数分裂过程中染色体行为分析、细胞融合培养过程中染色体行为和细胞变异等遗传现象的分析具有重要的意义。另外，基因工程育种在基因水平上产生的变异，也可以通过以染色压片为基础的染色体分带、原位杂交、荧光原位杂交进行基因定位。
[0003]鉴定植物的染色体数目是染色体分析的一种非常重要的分析，一般经常采用生长活跃的材料组织进行。茎尖和根尖通常被认为是生长活跃的组织，是有丝分裂的高发区，因而成为染色体计数常用的材料。相对于根尖和茎尖而言，花芽很少作为染色体计数分析的材料，原因可能是花芽中存在的色素等物质干扰，需要特殊的更加耗时耗力的前处理，而且取材时间受到更多的限制，如破坏植株的生长状态。
[0004]蔷薇属(Rosa)植物是世界著名的观赏植物，包括蔷薇、月季和玫瑰等，该属有200多个种，广泛分布于寒温带至亚热带地区。作为世界性的观赏植物之一，蔷薇属植物的栽培品种有30000多个，遗传背景非常复杂，染色体数目及倍性差异较大，目前已知有2，3，4，5，6，8和10倍体和非整倍体等，这是造成远缘杂交不亲和与杂种高度不育的主要原因，也是人们通过杂交育种获得优良目标性状的主要障碍。因此，在杂交育种前很有必要对亲本材料进行染色体倍性鉴定。但是，由于蔷薇属植物为木本，且遗传背景复杂性，染色体为中小型，导致染色体计数分析难度大，鉴定草本植物例如香石竹的染色体数目的方法无法有效地应用于蔷薇属植物。另外，蔷薇属植物不易取到合适的材料、材料的组织细胞难以解离，造成染色体计数结果不准确、不稳定甚至无法计数，而且计数时间长，不适合快速准确地进行大批量品种的染色体数目鉴定。
[0005]常用于的鉴定植物染色体的材料是根尖，但蔷薇属植物的种子萌发比较困难，且实生后代有变异，尤其是月季(Rosa Hybrida)。另外蔷薇属很多种或品种扦插生根困难，扦插周期长，费时费力，产生的不定根容易木质化，不易把握取材时间，并且在做镜检时，显微镜视野中分裂相细胞少，染色体分散不良，难以进行染色体计数。虽有人报道用蔷薇属植物的幼嫩茎尖做材料，但是由于茎尖生长点的分裂相细胞数目有限，准确取材困难，且存在着组织细胞不易 解离以及细胞内含物或分泌物干扰压片效果等问题。在香石竹上可用花蕾鉴定染色体数目，但尚未见到利用蔷薇属植物的花芽作为染色体计数分析的材料的报道。
[0006]尽管蔷薇属植物的染色体数目计数分析难度很大，但非常重要。尤其是需要开发出准确快速鉴定蔷薇属植物染色体的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为了解决上述问题中的一个或者全部问题。为此，本发明采用如下技术方案:
[0008]1.一种鉴定蔷薇属植物的染色体数目的方法，所述方法依次包括如下步骤:
[0009]( I)取材步骤:获取来自蔷薇属植物的材料；
[0010](2)预处理步骤:使用预处理液对所述材料进行处理；
[0011]( 3 )固定步骤:使用固定液对所述材料进行固定；
[0012](4)解离步骤:使用解离溶液对所述材料进行解离；
[0013](5)染色步骤:使用染色溶液对所述材料进行染色；
[0014](6)压片步骤:对所述材料进行压片；和
[0015](7)镜检步骤:通过使用显微镜对所述材料进行检测来确定所述材料的细胞中的染色体的数目；
[0016]其中，在所述压片步骤中，以28至34N的力对所述材料上的盖玻片垂直敲击160至200次。
[0017]2、如技术方案I所述的方法，其中，所述敲击分为依次进行的第一遍敲击和第二遍敲击，并且使用带有橡皮末端的未削铅笔进行，所述第一遍敲击以28N至34N的力垂直敲击所述材料上的盖玻片80-10·0次，所述第二遍敲击以相同的力度和次数进行垂直敲击，并且所述第一遍敲击使用所述铅笔的橡皮末端进行，所述第二遍敲击采用所述铅笔的另一末端进行。
[0018]3、如技术方案I或2所述的方法，其中，所述压片步骤通过如下方式进行:将经染色的所述材料放置在载玻片上，然后滴上45体积％的醋酸溶液，盖上盖玻片，用吸水材料吸走多余的溶液，盖上一层滤纸，左手按住盖玻片的一端，右手拿铅笔依次进行所述第一遍敲击和所述第二遍敲击，最后将盖玻片压平并去掉滤纸。
[0019]4、如技术方案I至3中任一项所述的方法，其中，所述材料为经过电镜扫描预检测确认具有生长点的材料和/或经过电镜扫描预检测确认了生长点位置的材料。
[0020]5、如技术方案I至4中任一项所述的方法，其中，所述材料为选自由根尖、茎尖或花芽组成的材料，优选的是，所述材料为茎尖和/或花芽；更优选的是，所述材料为花芽。
[0021]6、如技术方案I至5中任一项所述的方法，其中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的时间获取，并且为茎尖和/或花芽，更优选为花芽。
[0022]7、如技术方案I至6中任一项所述的方法，其中，所述茎尖取自于一年生主枝条和/或两年生侧枝条；优选的是，所述茎尖是长度为1.5mm至3mm的顶芽物，所述花芽是高度为1.5mm至2.5mm的花芽顶端组织。
[0023]8、如技术方案I至7中任一项所述的方法，其中，所述预处理液为由选自由对二氯苯、8-羟基喹啉、秋水仙素和α-溴萘等组成的组的预处理剂配制的溶液，优选的是，所述预处理液为对二氯苯饱和水溶液。
[0024]9、如技术方案I至8中任一项所述的方法，其中，所述预处理步骤通过如下方式进行:用解剖刀将所述材料切成两个部分，放入装有对二氯苯饱和水溶液的容器中，用封口膜将所述容器密封，使用注射器抽气至所述材料沉入处理液底部，再在20°C至25°C预处理2小时至3小时，然后用去离子水进行清洗。[0025]10、如技术方案I至9中任一项所述的方法，其中，所述固定步骤采用如下方式进行:将所述材料放置在装有卡诺固定液的容器中并将该容器放置在冰盒中固定4小时至6小时，然后用水进行清洗，所述卡诺固定液由体积比例为3:1的无水乙醇和冰醋酸组成。
[0026]11、如技术方案I至10中任一项所述的方法，其中，所述解离步骤采用如下方式进行:使用0.8M至1.2M盐酸水溶液于55°C至65°C水浴中对所述材料解离8分钟至10分钟，再用水进行清洗。
[0027]12、如技术方案I至11中任一项所述的方法，其中，所述染色步骤通过如下方式进行:将所述材料放置在装有染液的容器中染色10分钟至30分钟，所述染液为卡宝品红染液，然后用水进行清洗；优选的是，所述染液的用量为刚好没过所述材料。
[0028]13、如技术方案I至12中任一项所述的方法，其中，所述镜检步骤通过如下方式进行:使用100倍显微镜找到所述材 料的观察目标范围，然后使用400倍镜寻找处于分裂期的细胞，再利用1000倍油镜观测染色体的数目；优选的是，先利用1000倍油镜拍摄图片，然后再根据图片对染色体进行计数。
[0029]本发明首次在取材前将材料进行电镜扫描，使取材大小和位置更加精确、快速和高效；同时将花芽尤其是幼嫩花芽作为材料，使取材多样化。这种事先对所取材料进行电镜扫描可视化，以及将幼嫩花芽作为处理材料的方法适合更多扦插生根不易，多季开花的木本植物体细胞染色体观察。
[0030]与现有技术相比，本发明具有例如以下优点:(I)取材准确，有必要时可先对材料进行电镜扫描，使取材定位精准，直观，解决了一直以来蔷薇属植物染色体观察中存在的准确取材困难的问题。(2)取材多样化，包括花芽和茎尖，可以摆脱取材时间的限制。(3)鉴定速度快，整个过程各步骤时间容易把控，可在一个工作日内完成鉴定和/或能在24时内得到鉴定结果。(4)鉴定费用低，材料预处理剂比较廉价，鉴定所用工具容易获得，并可重复利用。(5)预处理效果好，用注射器对预处理容器抽真空，使材料的预处理时间缩短，效果更佳。(6)压片技术精准，压片时的敲击力度和敲击次数精确，使染色体分散均匀，计数准确，可重复性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为茎尖电镜扫描图。A:生长点较少的茎尖(多花蔷薇，蔷薇类)；B:顶端生长点较多的茎尖(月月粉，月季花)；C:花芽(B卩，花序分生组织包含有幼嫩花蕾和正在发育的小花蕾)(月月粉，月季花)。
[0032]图2为不同取材时间在400倍下可观察到的分裂相的细胞数目统计曲线图，其中所使用的材料为多花蔷薇；取材位置为茎尖；每间隔Ihr取材一次。对一个视野中处于分裂相的细胞进行计数。结果显示取材优选在上午9:00-11:00或者下午3:00至4:00进行,尤其以上午9:00-11:00取材的效果最好。
[0033]图3:A:月月粉花芽(2n=2x=14) ;B:月月粉茎尖(2n=2x=14) ;C:多花蔷薇(2n=3x=21);D:萨曼莎(4n=28);E:白玉堂缺失两条染色细胞(2n=12)H:白玉堂(2n=2x=14);F:压片力度和敲打次数不够，染色体和细胞分散不均匀；G:狗蔷薇(2n=5x=35) ；1:压片力度，敲片次数和取材时间均采用本发明的方法进行时在400倍光镜下细胞情况。【具体实施方式】
[0034]如上所述，蔷薇属植物由于遗传背景复杂，植物组织干扰物多，染色体小，计数分析存在取材不理想、分析周期长、可重复性差、结果不准确，不适合进行大批量材料的染色体计数等问题。另一方面，蔷薇属植物的染色体分析对例如育种又非常的重要和必要。为了解决现有技术中蔷薇属植物染色体计数分析所存在的例如上述诸多问题，本发明人在这方面进行了长期的观察和研究，最终开发出了一种快速准确鉴定蔷薇属植物的染色体数目的方法。
[0035]本发明提供了一种快速准确鉴定蔷薇属植物的染色体数目的方法，所述方法包括如下步骤:
[0036]( I)取材步骤:获取来自蔷薇属植物的材料；
[0037](2)预处理步骤:使用预处理液对所述材料进行处理；
[0038]( 3 )固定步骤:使用固定液对所述材料进行固定；
[0039](4)解离步骤:使用解离溶液对经固定的所述材料进行解离；
[0040](5)染色步骤:使用染色溶液对经解离的所述材料进行染色；
[0041](6)压片步骤:对经染色的所述材料进行压片；和
[0042](7)镜检步骤:通过使用显微镜对经压片的所述材料进行检测来确定所述材料的细胞中的染色体的数目；
[0043]其中，在所述压片·步骤中，以28至34N (例如可以为28、29、30、31、32、33或34N(牛顿))的力垂直敲击所述材料上的盖玻片160至200次(例如160、165、170、175、180、185、190、195 或 200 次)。
[0044]在一些优选的实施方式中，所述敲击分为依次进行的第一遍敲击和第二遍敲击，并且使用带有橡皮末端的未削铅笔进行，所述第一遍敲击以28N至34N(例如可以为28、29、30、31、32、33或34N(牛顿))的力垂直敲击所述材料上的盖玻片80-100次(例如可以为80、85,90,95或100次)，所述第二遍敲击优选以相同的力度和次数进行垂直敲击，并且所述第一遍敲击使用所述铅笔的橡皮末端进行，所述第二遍敲击采用所述铅笔的没有橡皮的另一末端进行。当然，也可以采用别的工具来代替带有橡皮的未削铅笔来敲击，但是优选敲击用的工具具有弹性部位和刚性部位，所述第一遍敲击采用弹性部位进行，使所取材料大块组织能够缓冲分散开成一个个细胞，并能将各个细胞压扁；所述第二遍敲击采用刚性部位进行，使第一遍敲击分散开的细胞铺展到一个平面上，利于后期镜检观察和拍照。
[0045]在一些实施方式中，所述压片步骤例如可以通过如下方式进行:将经染色的所述材料放置在载玻片上，然后滴上45体积％的醋酸溶液，盖上盖玻片，用吸水材料(例如滤纸)吸走多余的溶液，盖上一层滤纸，左手按住盖玻片的一端，固定盖玻片，防止其滑动；右手拿铅笔依次进行所述第一遍敲击和所述第二遍敲击，最后例如用拇指将盖玻片压平并去掉滤纸。
[0046]本发明人发现，蔷薇属植物的染色体计数分析的一个关键之处在于是否能够在保证细胞的完整性的情况下使材料组织能够充分解离并且染色体能够充分分散，这一点与制片过程中的压片步骤尤其是压片力度的关系尤其紧密。压片力度不足，组织细胞展开的效果差，导致镜检困难甚至无法得到准确的结果；压片力度过大，同样可能由于细胞的完整性遭到破坏而无法得到单个细胞的染色体数目。因此，本发明人通过将压片所需的总力度分解为采用特定的力度和敲击次数的组合。由于对压片的力度和次数进行数字化，因此可以在保证细胞完整的情况下，使压片效果更佳，所得结果的重复性更好，也方便于将本发明方法进行机械化操作。
[0047]另外，本发明还发现，鉴定蔷薇属植物的染色体数目的另一个关键之处在于材料的获取。如果取材不当，后期处理可能需要很长的时间，例如现有技术中有的甚至需要放置在冰水中20小时以上，有时甚至可能无法得到所需要的结果。本发明人发现，采用电镜扫描对材料进行预检测以确认该材料的生长点情况或者生长点的位置，如此可以起到事半功倍的效果。后来，从大量的电镜扫描结果发现，茎尖(请参见图1A和1B)和花芽(如图1C)如果取材适当、压片合理，非常适合用来分析染色体数目。尤其是对于花芽，一般认为花芽含有色素等干扰物质多，不适合于染色体数目的分析，尽管后来在其他植物中也有采用花芽来进行染色体数目分析的报道，但是采用所报道的方法来对蔷薇属植物的染色体数据进行分析却没有获得成功。后来本发明进行了不断的尝试，终于找到能够以花芽为材料分析染色体的方法，并且获得了非常理想的结果。因此，在一些实施方式中，所述材料优选为茎尖和/或花芽；更优选的是，所述材料为花芽。
[0048]在一些实施方式中，所述茎尖和/或花芽取自于一年生主枝条和/或两年生侧枝条；优选的是，所述茎尖是长度为1.5mm至3mm的顶芽物(如图版1A，B)，所述花芽是高度为
1.5_至2.5_的花芽花序顶端组织(如图版1C)。例如，可以取露天栽培生长旺盛的顶端包裹紧实圆润的长度为1.5-3mm的顶芽(含侧芽)以及生长圆润的长度为1.5-2.5mm的幼嫩花芽。取材时优选选取茎顶端包裹紧实圆润的茎尖，茎顶端分生组织较多。也可以同时借助于电镜扫描的手段通过将外部形态和微观形态相结合，使取材更精确化，这样可以缩小所取材料的体积，缩短预处 理时间，压片效果更好。
[0049]另外，本发明人发现，合理的取材时间可以使材料更适合于染色体数目的鉴定。在一些实施方式中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的时间获取，更优选在上午10:00进行取材(请参见图2)。另外优选的是，所述材料为茎尖和/或花芽，更优选为花芽。
[0050]本发明对预处理液没有特别的限制，可以使用本领域常用的预处理剂，例如可以使用选自由对二氯苯、8-羟基喹啉、秋水仙素和α-溴萘等组成的组的预处理剂。其中，秋水仙素常用浓度是:0.05%-0.2%，适用范围广，对大、中、小型植物染色体预处理均有好的效果。但是该试剂剧毒，见光易分解，且价格昂贵。8-羟基喹啉,常用浓度为0.002mol/L,适用于中小型染色体的植物，但是它的效力比较温和，使用该试剂进行预处理的时候，需要的预处理时间比较长，一般是4-6小时，并且累计中期染色体的数目不如其他预处理剂高。α -溴萘比较适合禾本科和水生植物的预处理，其他植物应用比较少。对二氯苯饱和水溶液的作用效果比较强烈，使用范围比较广，适用于大、中、小型植物染色体观察，且价格便宜，预处理时间短，更适合用于品种繁多的蔷薇属植物染色体的倍性的快速鉴定。于是，在一些优选的实施方式中，所述预处理液为对二氯苯饱和水溶液。例如在一些实施方式中，所述预处理步骤可以通过如下方式进行:用解剖刀将所述材料切开成两个部分，放入装有对二氯苯饱和水溶液的容器中，用封口膜将所述容器密封，使用注射器抽气至所述材料沉入到处理液的底部，再在20°C至30°C预处理2小时至3小时，然后用水进行清洗。预处理的温度例如可以为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30°C，处理时间可以例如为2、2.5或3小时。更优选的是，预处理的温度为25°C，并且预处理时间为2.5小时。如果处理温度过高，则可能易于诱发染色体发生粘连；如果处理温度过低，则可能无法使染色体快速浓缩。另外，如果处理时间过长，则易于诱导染色体粘连；如果处理时间短，则染色体浓缩程度不够而不利于分离计数。
[0051]本发明对固定液没有特别的限制，但是在一些优选的实施方式中，将所述材料放置在装有卡诺固定液的容器中并将该容器放置在冰盒中固定4小时至6小时，然后用水进行清洗，所述卡诺固定液由体积比例为3:1的无水乙醇和冰醋酸组成。
[0052]本发明对解离所用的解离溶液没有特别的限制，但是优选使用0.SM至1.2M盐酸水溶液，例如0.8,0.9、1.0、1.1或1.2M的盐酸水溶液，于55°C至65°C水浴中对所述材料解离8分钟至10分钟，再用水进行清洗。优选的是，可以将解离溶液于例如50°C至70°C预热两分钟，以使材料能够更加快速地进入解离状态。水浴的温度例如可以为55、60或65°C，更优选为60°C。如果温度过高或者处理时间过长，则可能会造成染色体上DNA分子降解严重，染色体着色较浅，不利于观察；如果温度过低或者处理时间过短，则可能会使细胞分离不充分，细胞核和细胞质着色反差不大，不易于压片和观察。 [0053]本发明对染色溶液没有特别的限制，但是优选使用卡宝品红(也称石碳酸品红，是80年代常用的一种染色体染色剂，也是目前国内应用最广泛的一种植物染色体染色剂，(请参见李懋学，“介绍一种核和染色体的优良染色剂”，生物学通报，1982,5:53)染液。例如可以采用如下方式进行所述染色步骤:将所述材料放置在装有作为染液的卡宝品红染液的容器中染色10分钟至30分钟(例如可以10、15、20、25或30分钟)，然后用水进行清洗。卡宝品红染液可以通过以下方式进行配置:先配成三种原液，再配成染色液,原液A:3g碱性品红溶于100ml70%酒精中；原液B:取原液A IOml加入到90ml 5%石炭酸水溶液中；原液C:取原液B 55ml，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林(38%的甲醛)。其中，原液A和原液C可长期保存，原液B限两周内使用。染液的配制:取原液ClO — 20ml，加45%冰醋酸80_90ml，再加山梨醇1.8g，配成10%-20%浓度的石炭酸品红液，优选放置两周后使用，效果显著，如果配制后立即用，则着色能力稍差。
[0054]在一些优选的实施方式中，所述染液的用量为刚好没过所述材料。本发明方法染色充分，操作简单、卫生，并且染液可重复利用。
[0055]本发明对镜检步骤所使用的仪器没有特别的限制，只要能够清晰观察到细胞的染色体数目即可，但是优选的是该仪器具有拍摄功能，使得可以利用仪器对照片进行自动扫描观察并分析染色的数目成为可能，从而可以免除采用人工的方式进行染色体计数的需要，由此使得本发明的方法更加适合于大批量的染色体数目计数分析。例如，在一些实施方式中，可以使用100倍显微镜找到所述材料的观察目标范围(例如，细胞分散、核区被染色的区域)，然后使用400倍镜寻找处于分裂期的细胞，再利用1000倍(目镜10x，物镜IOOx)油镜对染色体数目进行计数。或者利用1000倍油镜拍摄图片，最后再根据所拍摄的图片对染色体进行计数。
[0056]在本发明方法的一些实施方式中，可以在取材前对茎顶端或者花芽进行电镜扫描，方便快速准确取材；以幼嫩花芽作为材料可以使得取材多样化。在本技术中所取材料是生长在自然状态下的植物茎尖，在取材时，优选控制各个步骤的处理时间，如此当天就可以得到检测结果。在操作过程中，可以使用体积为20ml的带橡胶塞的医用瓶作为容器，并用一次性针管的针头部位插入瓶中抽气，使材料的预处理效果更好。另外，压片时精确了敲片的力度(28-34N)和敲片的次数(80-100次)，制片效果较好，染色体分散均匀易计数，又不会导致染色体丢失，影响计数的准确性。一般情况下，如果压片的力度超过34N和/或敲打次数高于100次时，细胞完整性不好，染色体会缺失而影响计数的准确性；当压片的力度低于28N和/或敲打次数低于80次时，染色体分散性不好，难以计数。
[0057]在一些实施方式中，本发明可以通过如下方式进行:
[0058]在预检测时，取材前先检测植物的幼嫩一年生长枝条(或者称为主枝条)、两年生侧枝萌发短枝条和花芽的顶端进行电镜扫描，了解生长点分布位置和数量，确定该属植物露地生长旺盛，一年生幼嫩长枝条，长度为1.5-3mm的顶芽物和长度为1.5-2.5mm外形圆润饱满的幼嫩花芽生长最旺盛，生长点最多，最适合做染色体计数。
[0059]取材在上午9:00至10:00或者下午3:00至4:00进行，取露天栽培生长旺盛的顶端包裹紧实圆润的长度为1.5-3mm的顶芽(可以含侧芽)及生长圆润的长度为1.5-2.5mm的幼嫩花芽。取材时要选取茎顶端包裹紧实圆润的茎尖，这样的茎顶端分生组织较多。
[0060]预处理时，可以将顶芽和/或侧芽或者花芽用解剖刀横切成两半，然后放入对二氯苯饱和水溶液里，用封口膜将医用瓶口封住，注射器抽气至材料沉入处理液底部，使预处理液与材料充分结合，提高预处理的效果。25°C左右预处理2.5h，用水清洗。
[0061]固定时，可以使用卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)，优选现用现配，在冰盒中固定4小时至6小时(例如可以为4小时、5小时或6小时),使细胞被充分杀死,再用水清洗。
[0062]解离时，可以将IM盐酸水溶液预热例如2分钟，然后于例如60°C水浴中用其解离例如8分钟至10分钟，然后用水清洗。
[0063]染色时，可以使用卡宝品红染液染色例如10分钟至30分钟。例如，可以将材料统一放在装有染液的废弃医用瓶中，染色剂的量以刚刚没过材料为佳。这样不但节省染色剂，还方便卫生，快捷，压片效果更好。
[0064]压片时，可以取染液里的材料，用45%醋酸和带橡皮的铅笔压片。滴一滴醋酸溶液，小心盖上盖玻片，用吸水纸吸走多于的溶液。盖上一层滤纸，左手按住盖玻片的一端，固定。右手拿铅笔，先用带橡皮的铅笔的橡皮端，用28-34N的力垂直敲打材料所在目标位置的盖玻片80-100次左右，再用未削笔头的一端相同力度相同次数敲片，最后用拇指按平，从而使细胞分散均匀，染色体能够分布在同一个平面上。一般情况，压片所需时间为4-6min每张片子，每个材料压5-8张片子，30min左右一个材料。
[0065]镜检时，可以在100倍镜下观察，寻找观察目标范围，400倍镜下寻找处于分裂期的细胞，1000倍油镜(滴一滴松柏油)拍照。每张压好的片子,观察和拍照需要8-15min,每个材料需要Ih左右。
[0066]如果采用花芽作为材料，优选使用幼嫩的花芽，例如为分化花芽之后且在减数分裂之前花芽(请参见图1C)，该阶段的植物处于花期，外形看不出来有花蕾和花序的形态，但是可以观察到饱满圆润的顶端。
[0067]在清洗时，优选都采用去离子水冲洗3-5遍，每遍清洗5min左右，清洗用具可以采用胶头滴管紧贴瓶底，以防止材料随液体被吸出。
[0068]本领域的技术人员应当知晓本发明中所使用的饱和对二氯苯水溶液和卡宝品溶液。例如，可以参考例如李懋学等《作物染色体及其研究技术》(第I版，1996年8月)中的配制方法。
[0069]与传统的蔷薇属植物采用顶芽进行染色体计数技术相比，本发明取材前例如可以对茎尖和幼嫩的花芽顶端进行电镜扫描，使取材可视化和精确化，解决了茎尖取材困难，非分生细胞干扰，根尖木质化程度高，种子生根困难，扦插生根周期长，根长和生根时间不易控制等问题。采用幼嫩花芽进行染色体压片，取材方便，不会破坏植株的生长状态，处于中期分裂相的细胞数目多，解决了蔷薇属植物茎尖维管组织干扰，染色体小，计数困难的难题。另外，本发明中，取材可以为自然状态下的生长旺盛的顶芽和花芽。如果上午9:00开始取材，适当控制预处理、固定、解离、染色的时间，并采用上述压片方法，可以在12h内快速、高效、准确地鉴定出染色体的数目。此外，如果在取材前先进行电镜扫描，使取材精确化，多样化，节省时间，制片效率高，染色体分散均匀，易计数。当然，本发明也适合其他材质木质化程度高和多季开花的林木植物进行快速高效的染色体计数。
[0070]下文将通过实施例的方式对本发明进行进一步的说明，但是这些实施例仅以举例方式给出，这些实施例不应被理解为是对本发明的限制。
[0071]实施例
[0072]实施例中所使用的仪器和药品均可以商购获得，没有使用专门的设备或者特制的药品。所有试剂均购自北京化学试剂公司，本发明实施例中所使用的体视镜为Nikon (尼康)smz800,染色观察所使用的显微镜型号为Olympus (奥林巴斯)BX51。
[0073]实施例中用到的材料，在进行取材之前，均进行了电镜扫描。其中实施案例3，4，6中的多花蔷薇、白玉堂和狗蔷薇属于蔷薇类，扫描结果为图1A所示类型；实施案例2，5中月月粉和萨曼莎茎尖为月季类的，扫描电镜确定为图1B的类型；实施例1的月月粉花芽扫描电镜结果为图1C所示类型。
[0074]实施例1
[0075]以2倍体的月月粉(R.chinensis ‘Old Pink Daily’.)幼嫩花芽作为材料进行。
[0076]A、上午9:00，取露地栽培的处于花期的枝条顶端，外部形态圆形紧实的幼嫩花芽，在体视镜下迅速剥取高度为2.0mm左右的材料。
[0077]B、使用对二氯苯，25°C处理3h。幼嫩花芽的顶端为未展开的花萼片，上面密被绒毛，在处理前用解剖刀在体视镜下切掉顶端0.5mm，放入装有20ml的饱和对二氯苯溶液中，用带针头的注射器抽真空至材料沉到预处理液底部，然后以去离子水清洗5遍。
[0078]C、使用卡诺固定液于冰盒中固定5小时,然后去离子水清洗5遍。
[0079]D、在60°C以IM盐酸解离lOmin，然后去离子水清洗5遍。
[0080]E、染色:使用卡宝品红染液染色20分钟。材料统一放在装有染液的容积为20ml的废弃医用玻璃瓶中，染色剂的量刚刚没过材料。
[0081]F、取染液里的材料，滴一滴45%醋酸溶液，小心盖上盖玻片，用吸水纸吸走多余的溶液。盖上一层滤纸，左手按住盖玻片的一端，固定。右手拿铅笔，先用带橡皮的铅笔端，用30N的力垂直敲打材料所在目标位置的盖玻片90次(即，第一遍敲击)，再用未削笔头的一端相同力度相同次数敲片(即，第二遍敲击)，最后用拇指压平，使细胞分散均匀，染色体分布在同一个平面上。
[0082]G、镜检:在100倍镜(Olympus, BX51，下同)下观察，寻找观察目标范围，在400倍镜(Olympus，BX51，下同)下寻找处于分裂期的细胞，1000倍油镜(滴一滴松柏油)拍照(结果见图3A)。
[0083]实施例2
[0084]以2倍体月月粉(R.chinensis ‘Old Pink Daily’.)茎尖作为材料。
[0085]上午9:00，取露地栽培的生长旺盛的一年生枝条顶端，在体视镜下迅速剥取长度为1.5mm左右的茎。于对二氯苯饱和溶液中在25°C处理2.5h，去离子水清洗5遍；以IM的盐酸解离8min。第一遍敲击和第二遍敲击均以28N的力度和80的次数进行；其余步骤同案例(I)中所述，结果请参见图3B。
[0086]实施例3
[0087]以2倍体白玉堂(R.multiflora var.albo-plena)莖尖作为材料。
[0088]上午9:00,取露地栽培一年生幼嫩枝条顶部2cm,在体视镜下一层一层剥去周围的叶片，露出茎顶端部位，用解剖刀切取前端长度为2.5_左右的顶端生长点部位。对二氯苯饱和溶液25°C处理3.0h0此材料新长出的幼嫩顶芽的叶片上面密被白色绒毛。卡诺固定液固定4小时，IM盐酸水溶液解离9min。第一遍敲击和第二遍敲击均以34N的力度和100的次数进行。其余步骤同案例(I)中所述，结果请参见图3E和3H。从结果中可以看到，2倍体的白玉堂染色体存在缺失问题，如图3E中，2n=2x=12 ;图3H中2n=2x=14。这些细胞来自相同的取材部位。由此可以看出，使用本发明方法可以检测到细胞中染色体缺失的现象。
[0089]实施例4
[0090]以3倍体多花蔷薇(R.multiflora, sp)莖尖作为材料。
[0091]上午9:00，取露地栽培的木质化程度不高的，颜色翠绿，顶端包裹紧实的2cm幼嫩茎尖，在体视镜用解剖刀切取顶端长度为2.5_左右的顶端生长点部位。对二氯苯饱和溶液25°C处理3h。该材料嫩叶周围有白色细小的绒毛。卡诺固定液固定3h，IM盐酸水溶液解离lOmin。当第一遍敲击和第二遍敲击均以29N的力度和95的次数进行,其余步骤同案例(I)中所述时，结果请参见图3C。当第一遍敲击和第二遍敲击均以25N的力度和80的次数进行，其余步骤同案例(I)中所述时，结果请参见图3F。
[0092]实施例5
[0093]以4倍体萨曼莎(R.hybrid cv.Samantha)莖尖作为材料。
[0094]上午9:00，取露地栽培一年生幼嫩，叶片发红枝条的顶部2cm，在体视镜下迅速剥取长度为2.8mm左右的茎尖。对二氯苯饱和水溶液25°C处理2.5h，去离子水清洗5遍；卡诺固定液4h，IM盐酸水溶液解离lOmin。第一遍敲击和第二遍敲击均以28N的力度和98的次数进行。其余步骤同案例(I)中所述，结果请参见图D。当以400倍显微镜观察时，所观测的结果如图31所示，从图31可以看到，处于分裂期的细胞数目比较多。这也说明，采用本发明的方法，在取材前，使用扫描电镜确定取材位置，对鉴定该属植物染色体倍性是非常有效的。
[0095]实施例6
[0096]以5倍体的狗蔷薇(R.canina)茎尖作为材料。
[0097]上午10:00，取露地栽培一年生幼嫩枝条的顶部2cm，在体视镜下迅速剥取长度为
3.0mm左右的茎尖。对二·氯苯饱和水溶液25°C处理3h，去离子水清洗5遍；卡诺固定液固定4h，IM盐酸水溶液解离lOmin，其余步骤同案例(I)中所述，结果如图3G。[0098]如图3所示，采用本发明方法检测到了 2倍体白玉堂染色体缺失2n=2x=12 (图版3E)，月月粉茎尖(2n=2x=14)，3倍体的多花蔷薇茎尖(2n=3x=21) ;4倍体的萨曼莎茎尖(2n=4x=28)以及5倍体的狗蔷薇茎尖(2n=5x=35)(图3G)。
[0099]此外，结合扫描电镜的结果，在取材的时候还发现，4倍体的萨蔓莎较2倍体月月红茎顶端分生组织大，取材时可放大取材范围。单季开花的蔷薇类嫩叶上面有绒毛，顶芽较大，取材时可以优选控制在3_左右。处于花期的植株，幼嫩花芽的外部形态圆润饱满，取材时容易识别，扫描电镜结果请参考图1C。
[0100]本发明在取材前对所取材料进行电镜扫描，结合体视镜的使用，将所取材料可视化，可以精确展现取材的大小和位置，解决细胞学研究中一直存在的取材困难的问题，这种方法也适合其他要进行细胞学研究的植物种类。取材时，幼嫩花芽作为预处理的材料，也可将其应用到其他多季开花的木本植物中进行细胞染色观察，多样化取材。在预处理时例如使用的废弃
[0101]廉价便宜，可重复利用，注射器抽真空处理效果更佳。本技术发明将压片的力度精准到28-34N，压片次数精准到80-100次，使压片力度和次数字化，适合现有的细胞染色体压片技术。染色时统一进 行，既方便卫生，又节省染色剂，使染色效果更佳。
【权利要求】
1.一种鉴定蔷薇属植物的染色体数目的方法，所述方法依次包括如下步骤: (1)取材步骤:获取来自蔷薇属植物的材料； (2)预处理步骤:使用预处理液对所述材料进行处理； (3)固定步骤:使用固定液对所述材料进行固定； (4)解离步骤:使用解离溶液对所述材料进行解离； (5)染色步骤:使用染色溶液对所述材料进行染色； (6)压片步骤:对所述材料进行压片； (7)镜检步骤:通过使用显微镜对所述 材料进行检测来确定所述材料的细胞中的染色体的数目； 其中，在所述压片步骤中，以28至34N的力对所述材料上的盖玻片垂直敲击160至200次。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述敲击分为依次进行的第一遍敲击和第二遍敲击，并且使用带有橡皮末端的未削铅笔进行，所述第一遍敲击以28N至34N的力垂直敲击所述材料上的盖玻片80-100次，所述第二遍敲击以相同的力度和次数进行垂直敲击，并且所述第一遍敲击使用所述铅笔的橡皮末端进行，所述第二遍敲击采用所述铅笔的另一末端进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述压片步骤通过如下方式进行:将经染色的所述材料放置在载玻片上，然后滴上45体积％的醋酸溶液，盖上盖玻片，用吸水材料吸走多余的溶液，盖上一层滤纸，左手按住盖玻片的一端，右手拿铅笔依次进行所述第一遍敲击和所述第二遍敲击，最后将盖玻片压平并去掉滤纸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述材料为经过电镜扫描预检测确认具有生长点的材料和/或经过电镜扫描预检测确认了生长点位置的材料；优选的是，所述材料为选自由根尖、茎尖或花芽组成的材料；更优选的是，所述材料为茎尖和/或花芽；进一步优选的是，所述材料为花芽；另外优选的是，所述茎尖取自于一年生枝条；更优选的是，所述茎尖是长度为1.5mm至3mm的顶芽的顶端组织，所述花芽是长度为1.5mm至2.5mm的花序顶端组织。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述材料在上午9:00-11:00或下午3:00至4:00的时间获取，并且为茎尖和/或花芽，更优选为花芽。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述预处理步骤通过如下方式进行:用解剖刀将所述材料切开成两个部分，放入装有对二氯苯饱和水溶液的容器中，用封口膜将所述容器密封，使用注射器抽气至所述材料沉入到处理液的底部，再在20°C至30°C预处理2小时至3小时，然后用水进行清洗。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述固定步骤采用如下方式进行:将所述材料放置在装有卡诺固定液的容器中并将该容器放置在冰盒中固定4小时至6小时，然后用水进行清洗，所述卡诺固定液由体积比例为3:1的无水乙醇和冰醋酸组成。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述解离步骤采用如下方式进行:使用0.8M至1.2M盐酸水溶液于55°C至65°C水浴中对所述材料解离8分钟至10分钟，再用水进行清洗。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述染色步骤通过如下方式进行:将所述材料放置在装有染液的容器中染色10分钟至30分钟，所述染液为卡宝品红染液，然后用水进行清洗；优选的是，所述染液的用量为刚好没过所述材料。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述镜检步骤通过如下方式进行:使用100倍显微镜找到所述材料的观察目标范围，然后使用400倍镜寻找处于分裂期的细胞，再利用1000倍油镜观测染色体的数目；优选的是，先利用1000倍油镜拍摄图片，然后再根据图 片对染色体进行计数。
【文档编号】C12Q1/68GK103710439SQ201310684352
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】赵梁军, 寇亚平, 赵宏伟, 高彬 申请人:中国农业大学