表达l-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。该基因来自谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，用PCR从谷氨酸棒状杆菌基因组DNA中扩增获得。L-赖氨酸转运蛋白基因的两端分别添加EcoRI和HindIII限制性酶切位点，和用相同的限制性内切酶进行酶切后的pKk223-3连接并转化，筛选，提质粒，电转化到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中，实现了在谷氨酸棒状杆菌中转运蛋白基因的倍增，表达产物L-赖氨酸转运蛋白分子量为25081.9Da。该重组L-赖氨酸转运蛋白或表达该重组转运蛋白的工程菌可以将L-赖氨酸由细胞内转运到细胞外，具有转运效率高，转运速度快，提高L-赖氨酸产率的优点。
【专利说明】表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。
【背景技术】
[0003]L-赖氨酸,属于天冬氨酸族氨基酸(L-aspartate family amino acids, AFAAS),包括L-赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸4种氨基酸，均为必需氨基酸)，是人类和动物必需氨基酸，自身不能合成的氨基酸之一，必须从体外摄取。具有多种生理功能，广泛应用于食品、医药以及饲料添加剂等。L-赖氨酸是蛋白质组成中必不可少的一个组成部分。作为营养元素，对人体的成长和发展的作用是明显的。它还是产生肉碱的一个重要组分，而肉碱可以将部分不饱和脂肪酸转化为能量，进一步降低胆固醇水平。在人体中，L-赖氨酸的功能是多种的，可以组成胶原蛋白，胶原蛋白负责结缔组织，肌肉，骨骼，肌腱，软关节等的组成。在钙的吸收方面，L-赖氨酸的作用也是明显的。
[0004]合成方法主要有:提取法，以动物血粉为原料，再从蛋白质水解物中，用离子交换法或苦味酸沉淀法分离提取L-赖氨酸；化学合成法，以化学物质为原料合成L-赖氨酸。主要运用的工艺是DSM法和东丽法，使用原料是己内酰胺和环己烯；酶合成法，以己内酰胺或二氢呋喃为起始原料，借助于有机合成与生物化学工程相结合的生产技术来生产L-赖氨酸；微生物发酵法，常以淀粉、甘蔗或甜菜制糖后的废糖蜜为原料，产生的L-赖氨酸都是L型，是目前工业上生产L-赖氨酸的最主要方法。
[0005]L-赖氨酸代谢工程`育种主要体现在大肠杆菌和棒状杆菌(如谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和乳糖发酵短杆菌等)，而解析L-赖氨酸生物合成途径和关键酶基因序列是构建高产L-赖氨酸工程菌的前提和基础。
[0006]L-赖氨酸在细胞内部积累会对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶产生反馈抑制。天冬氨酸激酶(简称AK)，可分为AK-1，AK-1I，AK-1II，这三种酶为同工酶，都具有将L-天冬氨酸转化成L-天冬氨酸-β-磷酸的功效。其中AK-1 ,AK-1I为复合酶，均带有高丝氨酸脱氢酶，高丝氨酸脱氢酶可将L-赖氨酸生物合成的前体物质天冬氨酸半醛转化成L-高丝氨酸，与L-赖氨酸抢夺资源。AK-1II是单功能酶，为IysC基因的产物，受到L-赖氨酸产物抑制，是L-赖氨酸生物合成系统中的第二限速酶。二氢吡啶二羧酸合酶(简称DDPS)，也有翻译做二氢吡啶甲酸合酶，将天冬氨酸-β -半醛与丙酮酸脱水缩合生成二氢吡啶二羧酸，此酶负责L-赖氨酸合成系统中重要的调控位点，是L-赖氨酸生物合成的第一限速酶，受到L-赖氨酸反馈抑制与阻遏。
[0007]在发酵过程中，伴随着菌体的大量生长和菌体代谢的加快，L-赖氨酸也在细胞内不断地积累，加剧对天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合酶的反馈抑制。对合成途径中从天冬氨酸到L-赖氨酸的代谢流进行了限制，也限制了 L-赖氨酸的进一步发酵积累。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供了表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒、工程菌及应用。解决了现有技术存在的L-赖氨酸运送不足的问题。
[0009]表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E，其氨基酸序列为SEQ ID N0.3所示。
[0010]一种工程菌，该菌株AT-pkk-E-DE为谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.8183，保藏时间为2013年9月13日，由表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk_E转化谷氨酸棒杆菌获得。
[0011]表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E在制备L-赖氨酸中的应用。
[0012]谷氨酸棒工程菌在制备L-赖氨酸中的应用。
[0013]利用PCR方法筛选克隆出谷氨酸棒状杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因。
[0014]谷氨酸棒杆菌L-赖氨酸转运蛋白基因，该基因的DNA序列为SEQ ID N0.1,全长702bp，来自保藏菌株编号为1.1886 (菌株别号为ATCC13032)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum),在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏,该基因是一个已经报道的DNA序列，从NCBI数据库获得，其碱基组成特征如下表1所示:
表 I 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032 L-赖氨酸转运蛋白基因组成特征:
【权利要求】
1.表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E，其氨基酸序列为SEQID N0.3所示。
2.一种工程菌,该菌株AT-pkk-E-DE为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.8183，保藏时间为2013年9月13日，由表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E转化谷氨酸棒杆菌获得。
3.权利要求1所述的表达L-赖氨酸转运蛋白的重组质粒pkk-E在制备L-赖氨酸中的应用。
4.权利要求2所述的谷氨酸棒工程菌在制备L-赖`氨酸中的应用。
【文档编号】C12N15/77GK103695454SQ201310694012
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】高世军, 刘德玉, 唐春辉, 朱艳敏 申请人:山东寿光巨能金玉米开发有限公司