一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶，属于酶工程【技术领域】。本发明采用基因重组技术将葡萄糖氧化酶524位点的甲硫氨酸突变为亮氨酸，并转化入毕赤酵母Pichia?pastoris?GS115中，经筛选鉴定得到一株较原有菌株催化效率提高的菌株。该菌株表达的葡萄糖氧化酶在50mL摇瓶上酶活64.6U/mL，比野生型提高了近10%。催化效率Kcat/Km为76.98mM-1·s-1，比野生型（16.73mM-1·s-1）提高了近4.5倍。
【专利说明】一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶，属于酶工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品饲料医药等相关领域。
[0003]在食品工业中，由于氧的存在引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前许多国家已将GOD作为公认的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于将葡萄糖氧化形成过氧化氢和葡萄糖酸。利用其专一氧化酶的原理制成葡萄糖氧化酶分析仪能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量指导生产。在医药工业中GOD作为试剂盒酶电极等用于血清(浆)尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；G0D制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑牙垢和龋齿的形成，防止口腔疾病和牙病的发生。此外由于可以催化生成H2O2，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境调节饲料消化促进动物生长。含葡萄糖氧化酶乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂可用于预防牲畜胃肠道感染腹泻并有促进动物生长作用。
[0004]从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产G0D,日本常用尼奇青霉,俄罗斯用生机青霉。近年报道胶霉属(Clioctadium)、拟青霉属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产 G0D。
[0005]产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO0规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白分离提取复杂成本高。同时，葡萄糖氧化酶在生物传感器方面一直有着很广泛和重要的应用前景。继人们采用葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧电极而检测血糖水平之后，第二代传感器采用人工电子受体(又被称为电子介质或氧化还原染料)以代替氧作为电子受体。然而这一应用仍存在一些问题，譬如:采用氧化酶(GOD)的电子介质型生物传感器很容易受到样品中的溶解氧影响，因此采用对氧低敏感度的氧化酶相对来说具有很大的优势。本发明旨在提供一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种催化效率提高的葡萄糖氧化酶突变体，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列为出发序列，将第524位的甲硫氨酸M突变为亮氨酸L ;所得突变葡萄糖氧化酶命名为M524L。
[0007]编码SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0008]所述突变体M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本发明还提供了一株产所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以毕赤酵母(Pichiapastoris) GS115为宿主，以pPIC9K为载体，表达编码所述葡萄糖氧化酶突变体的基因。
[0010]所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤:PCR或化学合成得到编码突变体M524L的基因，连接表达载体pPIC9K，将重组质粒转化P.pastoris GS115，获得基因工程菌。
[0011]利用所述基因工程菌发酵产葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步骤:(1)将携带突变基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培养至OD6tltl=L 6-1.7，作为种子液；(2)将种子液以2% (v/v)的接种量转入基本发酵培养基，于30°C、200rpm条件下发酵培养；(3)当在基本发酵培养基中培养至OD6tltl=L 2-1.5时，收集菌体，将酵母细胞转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。
[0012]所述基本发酵培养基为BMGY培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油IOmL, YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸缓冲液。
[0013]所述诱导培养基为BMMY培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸缓冲液。
[0014]本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体M524L在摇瓶中的酶活比对照菌株的酶活提高了近10%，催化效率Kcat/Km为76.98^ ? s'比野生型(16.73mM_1 ? s’提高了近4.5倍。降低了生产成本，在工业上具有重大应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:各株突变菌株`的葡萄糖氧化酶的酶活比较。
[0016]图2:各株突变菌株的葡萄糖氧化酶的比酶活比较。
[0017]图3:催化效率提高型葡萄糖氧化酶蛋白电泳(SDS-PAGE) ；M:蛋白质分子量标准；2:突变株M524L纯化后；3:突变株M524L纯化前。
[0018]图4:各株突变葡萄糖氧化酶的pH稳定性比较。
[0019]图5:各株突变葡萄糖氧化酶的热稳定性比较。
【具体实施方式】
[0020]葡萄糖氧化酶酶活测定方法:G0D活性测定采用邻-联(二)茴香胺分光光度法。在有氧的条件下，GOD催化葡萄糖脱氢产生H2O2，在过氧化物酶(POD)作用下，氧供体邻-联(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色产物。测540nm处吸光度的变化，根据标准曲线的结果计算葡萄糖氧化酶活力单位。I个葡萄糖氧化酶活力(IU)定义为:在30°C、pH6.0的条件下，Imin将I mo I的P -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量为一个葡萄糖氧化酶酶活力单位。
[0021]实施例1重组菌的构建及鉴定
[0022]以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列为出发序列，分别将第524位的甲硫氨酸M、第305位的甲硫氨酸M突变为亮氨酸L。所得突变葡萄糖氧化酶命名为M524L、M305L。
[0023]以 Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D (CCTCC NO:M2012266)中的重组质粒PPIC9K-G0D为模板，定点突变获得含有不同突变GOD基因的载体pPIC9K_G0D，或分别化学合成突变后的基因、连接表达载体PPIC9K。
[0024]所用定点突变引物为:
[0025]M305L-F:5’GAATATTCCGGTATCGGACTGAAGTCCATCCTGGAG3’ ；
[0026]M305L-R:5’CTCCAGGATGGACTTCAGTCCGATACCGGAATATTC3’ ；
[0027]M524L-F:5’GTACTTGCTCCATGCTGCCGAAGGAGATG3’ ；
[0028]M524L-R:5’ATCTCCTTCGGCAGCATGGAGCAAGTAC3’ ； [0029]PCR反应体系:0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂:5XFD PCR buffer5 u I;DNTPMixture2 u I;模板DNAl u I ;上游引物各Iu I ；phusion酶0.5 y I ;加双蒸水至终体积为 25iil。5XFD PCR buf f er5 u I; DNTP Mixture2 y I;模板 DNAl y I ;下游引物各 I y I ;phusion酶0.5 ill ； DMSO 1.5 u I加双蒸水至终体积为25 yl。反应5个循环后，将对应PCR反应液混合，继续反应25个循环。PCR扩增条件:98°C预变性3min ;98°C变性15s ;53°C退火30s ;72°C延伸llmin (5个循环)；72°C延伸IOmin0混合后扩增条件:98°C变预变性3min ；98°C变性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin (25 个循环)；72°C延伸 IOmin0
[0030]限制性内切酶DpnI消化后，化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，37°C过夜培养。最终获得分别含有突变氨基酸GOD基因的载体PPIC9K-G0D。GOD突变体M524L的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，GOD突变体M305L的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。将测序正确的pPIC9K-G0D分别电击转化P.pastoris GS115感受态细胞，得到基因工程菌。
[0031]毕赤酵母的转化采用电转法:GS115于50mL YPD中培养至OD6tltl=L 2-1.5离心收集细胞；依次用400mL冰冷的无菌水洗两次细胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗一次细胞，重悬细胞于lmLlmol/L的山梨醇中。100 u L原生质体与5-10 u g线性化质粒DNA(MSSI切)混合转入冰冷的lmol/L山梨醇稀释菌体后涂布于固体MD培养基。30°C培养4_6天后挑取单克隆。
[0032]实施例2高表达菌株的筛选。
[0033]分别制备含lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL遗传霉素的YPD平板,将MD培养基上的单克隆依次点板到不同浓度的YPD平板上培养48小时后，挑取形态较大的菌落进行下一步的发酵培养。
[0034]实施例3重组菌的酶活测定和蛋白电泳
[0035]采用实施例2中获得的分别表达突变体M524L、M305L的酵母工程菌为生产菌株，活化后将在30°C、200rpm条件下培养到OD6tltl=L 6-1.7的种子以2% (v/v)的接种量转入基本发酵培养基(装液量为50mL/500mL)，于30°C、200rpm条件下发酵培养。在基本发酵培养基中培养至0D_=1.2-1.5时，离心收集全部菌体，生理盐水洗涤2次，重悬后菌体全部转入50mL(500mL三角瓶)液体诱导培养基中，置于30°C、200r/min摇床培养，每24h补加l%(v/v)的甲醇，诱导产酶。以表达野生型(即，未经突变的出发G0D)葡萄糖氧化酶的P.pastorisGSl 15为对照菌株。
[0036]培养基:种子和斜面培养基为YPD培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培养基添加琼脂20g。
[0037]基本发酵培养基为BMGY培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸缓冲液。[0038]诱导培养基为BMMY培养基(IL):胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸缓冲液。
[0039]发酵结束后获得发酵液，离心获得发酵上清，对酶进行纯化，纯化方法是阴离子层析，采用梯度洗脱的方法，最终获得较纯的葡萄糖氧化酶。
[0040]如附图所示，通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为68kDa的蛋白条带。同时在摇瓶过程中，M524L在发酵第6天达到最高酶活64.6U/mL,比对照菌株的酶活(58.7U/ml)提高了近10%。同时，相比野生型，突变株M524L的pH稳定性有所提高，在pH4-7内基本保持50%以上的活力，温度稳定性基本不变。
[0041]纯化后的葡萄糖氧化酶M524L经计算Km值为10mM，Kcat为767.98s—1。催化效率Kcat/Km为76.98mM_1.s'比野生型(16.73mM_1 *8^)提高了近4.5倍。对过氧化氢的耐受能力也有所提闻。
[0042]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定 的为准。
【权利要求】
1. 一种葡萄糖氧化酶突变体，是以SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列为出发序列，将催化活性中心的甲硫氨酸突变为亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，是将第524位的甲硫氨酸M突变为亮氨酸L，突变后的葡萄糖氧化酶的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.编码权利要求2所述葡萄糖氧化酶突变体的核苷酸。
4.携带权利要求3所述核苷酸的载体、基因工程菌或转基因细胞系。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，是以毕赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15为宿主，以pPIC9K为载体，表达编码所述葡萄糖氧化酶突变体的基因。
6.构建权利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，是通过PCR或化学合成得到编码突变体的核苷酸序列，连接表达载体pPIC9K获得重组质粒,将重组质粒转化P.pastorisGS115，获得基因工程菌。
7.应用权利要求5所述基因工程菌发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)将携带突变基因的基因工程菌活化后，在30°C、200rpm下培养至OD600=L 6-1.7，作为种子液；(2)将种子液以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30°C、200rpm条件下发酵培养；(3)当在基本发酵培养基中培养至OD6tltl=L 2-1.5时，收集菌体，将酵母细胞转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述基本发酵培养基为:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物10g/L，甘油10mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0的磷酸缓冲液。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为:胰蛋白胨20g/L，酵母抽提物 10g/L，甲醇 8mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0 的磷酸缓冲液。
10.权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体的应用。
【文档编号】C12N15/81GK103614350SQ201310699636
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】陈坚, 闻一凡, 张娟, 堵国成, 顾磊, 刘晓筱 申请人:江南大学