一种产酶溶杆菌突变菌株及其制备方法
【专利摘要】本发明提供的一种产酶溶杆菌(Lysobacter?enzymogenes)的突变菌株TGJZC-041，并利用此菌接种于营养琼脂培养基斜面，30±1℃静置培养2-3天，再以5%-10%接种量接种于发酵培养基，于30±1℃恒温摇床中以215-225rpm转速振荡培养3天制备赖氨酸肽链内切酶，其有益效果在于，本突变株产生的Lys-C表达量相对较高且发酵周期较短。
【专利说明】一种产酶溶杆菌突变菌株及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于诱变育种领域，特别涉及产酶溶杆菌太空诱变育种方法，以及太空诱变育种得到的产酶溶杆菌突变菌株。
【背景技术】
[0002]赖氨酸肽链内切酶Lys-C (Endoproteinase Lys-C)是一种碱性蛋白酶,分子量约为30kD，属于丝氨酸蛋白酶家族成员之一。它能特异性地水解蛋白质或肽链中赖氨酸残基的C端，也可用于通过肽质谱指纹印迹或MS/MS光谱匹配进行蛋白鉴定，因此在蛋白质组学分析中有着很好的应用前景。另外，Lys-C也可用于重组蛋白(如胰岛素及其类似物)工业生产中前体的切割，相比常用的胰蛋白酶，Lys-C具有几个显著优点:1.专一性强，酶活高，显著提高酶切转化率(由10%提高到约77%) ；2.显著提高酶切后的纯度(由11%提高到约80%) ；3.具有广泛的pH作用范围(pH8.5-10.5) ；4.稳定性高，在强变性剂如4mol/L尿素或0.1%SDS的溶液中依然保持大部分酶活性。
[0003]目前市场上的赖氨酸肽链内切酶(Lys-C)大多为天然菌种表达产物，价格极为昂贵,如Promega的Lys-C市价为每微克约370元。重组表达生产赖氨酸肽链内切酶(Lys-C)技术不成熟，商业化产品极少，Promega公司销售的重组Lys-C,市价为每微克约130元,与天然Lys-C相比，价格有一定的优势，但仍较为昂贵。国内尚未有赖氨酸肽链内切酶的生产企业。
[0004]目前已知有三种微生物可以合成Lys-C:铜绿假单胞菌，无色杆菌，产酶溶杆菌。主要由产酶溶杆菌表达生产，其次为无色杆菌培养液中分离得到。产酶溶杆菌作为Lys-C的主要产生菌，目前市场上该菌主要有原始菌，传代菌，以及各种亚种，生产Lys-C效率均不高，且发酵周期较长，这阻碍了 Lys-C的进一步应用。Chohnan S等在IOL罐上对 Lysobacter sp.1B-9374 发酵 9.4 `天后得到 10.9mg/L 的 Lys-C0 Philip A 利用Lysobacter enzymogenes ATCC27796 发酵 4 天得到 5.6mg/L 的 Lys_C。GB2083477A 报导，菌株 Lysobacter enzymogenes DSM1895 (即 ATCC27796)在 206L 耀上发酵后得到 50_140mg的目的蛋白，即产量为0.24-0.68mg/L。
[0005]上述报导的技术方法均存在生产周期过长或表达量较低的问题，因此筛选一株稳定高产、且发酵周期较短的Lys-C产生菌具有重要的研究和应用价值。
【发明内容】
[0006]为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一株产酶溶杆菌突变菌株。
[0007]本发明提供的一种产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)的突变菌株TGJZC-041，保藏号为CGMCC N0.8328，于2013年10月12日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮政编码为100101)。
[0008]本发明还提供一种产酶溶杆菌突变株的发酵方法。将突变株产酶溶杆菌(L.enzymogens) TGJZC-041接种于营养琼脂培养基斜面，30± 1°C静置培养2~3天，再以5%-10%接种量接种于发酵培养基，于30 土 1°C恒温摇床中以215-225rpm转速振荡培养3天；所述发酵培养基为:1% (W/ν)多聚蛋白胨，1% (W/V)蔗糖，0.01% (w/ν)磷酸氢二钾，0.01% (W/V)磷酸二氢钾，0.02% (W/V)硫酸镁，余量为纯化水，ρΗ7.2±0.I。
[0009]更进一步地，本发明提供一种产酶溶杆菌的突变株在制备赖氨酸肽链内切酶中的应用。
[0010]本发明的技术方案提供的一种产酶溶杆菌的突变菌株，其有益效果在于，本突变株产生的Lys-C表达量相对较高且发酵周期较短。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为不同氮源对Lys-C酶活的影响。代表Polypeton对Lys-C酶活的影响，代表Yeast extract对Lys-C酶活的影响，代表水解干酪素对Lys-C酶活的影响，-代表干酪素对Lys-C酶活的影响，代表Tryptone对Lys-C酶活的影响，代表干酪素+牛肉膏Lys-C酶活的影响。
[0012]图2为不同碳源对Lys-C酶活的影响。+代表1%蔗糖对Lys-C酶活的影响，
代表2%蔗糖对Lys-C酶活的影响，--τ代表1%葡萄糖对Lys-C酶活的影响，ΦΗ代表2%葡萄糖对Lys-C酶活的影响，_fr代表1%乳糖对Lys-C酶活的影响，代表2%乳糖对Lys-C酶活的影响，—代表山梨醇对Lys-C酶活的影响，+代表果糖对Lys-C酶活的影响。
[0013]图3为本发明产 酶溶杆菌在营养琼脂平板上生长3天后的菌落形态。 [0014]图4为纯化后得到的Lys-C的SDS-PAGE图；1:蛋白质marker ；2:纯化后样品。
【具体实施方式】
[0015]以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。
[0016]实施例1培养基的优化
[0017]培养基A:干酪素0.5%，蔗糖1%，牛肉浸膏1%，磷酸氢二钾0.01%，磷酸二氢钾
0.01%，硫酸镁 0.02%，调 pH 至 7.2±0.1。
[0018]以培养基A为初始培养基，进行氮源和碳源的简单优化。优化过程如下:
[0019]氮源的考察:培养基A中其他组分不变，分别以1%的多聚蛋白胨、1%的Yeastextract、1%的Tryptone、l%的水解干酪素、1%的干酪素及0.5%干酪素+1%牛肉膏作为氮源进行摇瓶发酵。在第3、4、5和6天取样进行酶活测定。结果结果如图1所示，确定以1%的多聚蛋白胨为最适氮源。
[0020]碳源考察:培养基A中其他组分不变，氮源为1%的多聚蛋白胨，考察分别以1%蔗糖、2%蔗糖、1%葡萄糖、2%葡萄糖、1%乳糖、2%乳糖、1%山梨醇及1%果糖为碳源进行摇瓶发酵。分别在发酵的第3、4、5和6天测定其酶活力。结果如图2，确定以2%蔗糖为最适碳源。
[0021]其中所述酶活力定义:在反应温度30°C，每分钟催化I μ mol的底物N-(p_T0Syl)-Gly-Pro-Lys-4-nitroaniIide acetate salt水解所需的酶量定义为I个酶活单位。[0022]酶活力测定方法:发酵结束后，取I μ M的Tris-HCL ΡΗ8.5的缓冲液180 μ L至96孔板,加入2mM底物10 μ L，再加入发酵液样品10 μ L作为反应体系，混匀并启动反应。每一样品设2次重复，结果取平均数。对照品与样品的区别在于加入标准品代替发酵液样品。空白对照与样品区别在于加入灭菌纯化水代替发酵液样品。用酶标仪30°C恒温测定405nm的动力学反应曲线，反应时间为30min。计算酶活情况。
[0023]实施例2初步筛选赖氨酸肽链内切酶高产菌株
[0024]从ATCC购买L.enzymogens,菌株号为ATCC27796,对该菌株复苏后，进行单菌落分离，取10-5，10-6，10-7等合适稀释度涂布营养琼脂培养基平板3个，30 土 TC静置培养2-3天；再转接于营养琼脂培养基斜面，30土 1°C静置培养2-3天；再以5%-10%接种量接种于发酵培养基发酵，装瓶量为16%，进行高通量筛选，发酵培养5天，然后进行酶活力测定。发酵培养基为:1% (W/V)多聚蛋白胨，1% (W/V)蔗糖，0.01% (W/V)磷酸氢二钾，0.01% (ff/V)磷酸二氢钾，0.02% (W/V)硫酸镁，余量为纯化水，pH7.2±0.1。将初筛菌株，以5%_10%接种量接种于发酵培养基(40mL培养基/250mL三角瓶)中发酵，于30 土 1°C恒温摇床中以215-225rpm转速振荡培养5天，然后进行酶活力测定。从732个单菌落中筛选到一株酶活较高的菌株L.enzymogens PGJZC30，将其作为太空诱变的出发菌株。
[0025]实施例3筛选赖氨酸肽链内切酶突变高产菌株
[0026](I)将自然选育得到酶活力最高的菌株L.enzymogens PGJZC30接种于LB液体培养基，至于温度为30±1°C且转速为215-225rpm的摇床中振荡培养20h进行复苏；用牙签一端沾湿培菌液后，穿刺于装有220 μ L的LB半固体培养基的太空管中，设置对照组及实验组各I管，30土1°C静置培养2-3天后，将实验组和对照组分别送至北京航天局，实验组于2013年6月搭载“神州十号”进入太空，接受空间宇宙射线、微重力、交变磁场等各种太空因素的诱变，并于17天之后随返回舱返回地面。期间，对照组一直在4°C放置。诱变结束后，分别对实验组和对照组菌液进行梯度稀释并涂布平板(单菌落数在50-300cfu)，培养2-3天后，进行平板计数，计算致死率。所述的致死率为(对照组活菌落数-搭载组活菌落数)/对照组活菌落数。其中发酵培养基同实施例2中的发酵培养基；LB液体培养基:0.5%(ff/V)Yeast Extract, 1%(W/V)Tryptone, l%(W/V)Nacl,余量为纯化水；LB 半固体培养基:LB 液体培养基含0.9%(ff/V)琼脂。结果如下表3:
[0027]表3太空诱变菌株致死率考察
[0028]
【权利要求】
1.一种产酶溶杆菌(L.enzymogens)的突变株，所述突变株为TGJZC-041，已于2013年10月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCN0.8328。
2.如权利要求1所述的突变株在制备赖氨酸肽链内切酶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述TGJZC-041接种于营养琼脂培养基斜面，30 土 I °〇静置培养2~3天，再以5%-10%接种量接种于发酵培养基，于30 ± I °C恒温摇床中以215-225rpm转速振荡培养3天，最终经纯化获得赖氨酸肽链内切酶；所述发酵培养基为，以W/V计:1%多聚蛋白胨，1%蔗糖，0.01%磷酸氢二钾，0.01%磷酸二氢钾，0.02%硫酸镁，余量为纯化水，pH7.2±0.1 ;所述营养琼脂培养基为:胰蛋白胨1.5%(W/V)，大豆蛋白胨0.5% (W/V)，氯化钠0.5% (W/V)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.I。
4.如权利要求3所述的应用，其中的纯化步骤为:上述发酵液经离心后，获得上清液；加入XAD1180至上清液中，并置于水浴振荡器中振荡3-4h，采用75%乙醇洗脱，收集洗脱样品；把收集到的洗脱样品调pH值至4.0-5.0,进行S-Sepharose ff阳离子层析,用0.2M氯化钠+0.01M醋酸钠(pH5.0)的洗脱液洗脱，收集洗脱样品；用81(滤膜超滤阳离子的收集液，最后冻干， 即可得到纯度较高，具有酶活的赖氨酸肽链内切酶冻干粉。
【文档编号】C12R1/01GK103865836SQ201310704805
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】刘长庭, 常德, 方向群, 王俊峰, 苏龙翔, 张学林, 严凌斌, 林树珊, 李利佳 申请人:中国人民解放军总医院, 广东东阳光药业有限公司