一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用。所述载体的T-DNA区结构为：右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因，其中正向双价抗病序列即甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，其DNA序列如SEQIDNO.1所示。得到的植物表达载体可用于转化获得同时具有4种抗性的转基因作物，并且获得的转基因作物没有抗生素抗性基因，可提高转基因作物的安全性。并且同一次转化中可获得同时具有4种抗性的转基因作物，与单一抗性的遗传转化相比，可以提高效率3倍以。
【专利说明】一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体及应用。
【背景技术】
[0002]甘蔗黄叶病、花叶病是严重危害甘蔗的农业生产和糖业健康发展的病毒病，甘蔗黄叶病属于黄症病毒科(Luteoviridae)马铃薯卷叶病毒(,其病毒由蛋白质外壳及其包裹着的一条单链、正义RNA( ssRNA)构成,在甘鹿体内含量很低,仅分布于其韧皮部筛管伴胞细胞质中。在全球30多个种植甘蔗的国家和地区均有发生，自2003年王伯辉等报道广西发现甘蔗黄叶病以来，在我国桂、粤、滇、琼、闽等蔗区也陆续出现，且有逐年加重的趋势。该病的发生导致甘蔗产量下降，品质变劣以及种性退化，严重时甘蔗产量减产高达40%~60%。而甘蔗花叶病属于马铃薯Y病毒组，其基因组为正单链RNA，约有10000个核苷酸，主要破坏甘蔗叶片的叶绿体，制约其光合作用，从而使甘蔗糖分减少，产量下降。据统计当该病病毒侵染率达到75%时，产量降低5%~19%，严重影响甘蔗产量。该病在我国广东、广西、浙江、福建、云南、江西、四川、台湾均有分布。螟虫是我国蔗区发生最普遍，危害最严重的甘蔗害虫，具有全生长季、钻蛀性危害的特点，苗期枯心率一般达10%~20%，严重的高达60%，Bt基因产生的毒蛋白对螟虫具有防治作用。甘蔗生长旺季田间管理难度大，人工成本高，随着我国甘蔗机械化栽培管理的逐步推广，减少田间管理成本的除草剂甘蔗品种更适宜机械化栽培管理模式。由于甘蔗是高度杂合的异源多倍体和多倍的非整倍体植物，其遗传背景非常复杂，并且抗病虫、除草剂的甘蔗资源缺乏，因此，很难通过杂交育种的方式获得高抗植株。
[0003]目前，转基因技术在植物抗病虫害方面已广泛应用。2011年张雨良等以甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因构建RNAi表达 载体，并成功转化到烟草中。2012年秦荣等利用RNAi技术成功构建了抗甘蔗花叶病、番茄花叶病的双价表达载体，2004年姚伟等获得转ScMV-CP基因的转基因甘蔗并进行了抗病分析，结果转基因甘蔗抗性明显高于非转基因甘蔗。2006年Weng等利用基因枪法将玉米泛素启动子Ubi驱动下的导入甘蔗，用获得了抗蛀茎虫的转基因甘蔗，2011年高世武等利用PPT筛选成功获得抗螟虫转基因甘蔗。甘蔗病虫害往往是多种同时出现，并趋于多样性，而现今获得的转基因甘蔗多属单一抗性的转基因改良，对甘蔗病虫害防治作用有限。对于感病毒病的作物，RNAi技术已经成为抗病毒转基因作物育种的有效途径。然而，到目前为止，同时抗两种病毒病并具有抗虫、抗除草剂的转基因甘蔗尚未见报道。本发明通过将甘蔗花叶病毒、黄叶病毒CP基因干扰序列、CrylAC基因和抗除草剂fer基因同时构建到植物表达载体上，利用基因枪创制了抗病虫和除草剂的四价转基因甘蔗，为培育多抗甘蔗新品种提供了新方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，可用于转化获得同时具有4种抗性的转基因作物，并且获得的转基因作物没有抗生素抗性基因，可提高转基因作物的安全性。
[0005]本发明首先提供了一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，是由甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQ ID N0.1 所示。
[0006]一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构，是将所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列以反向重复的方式与丙酮酸磷酸双激酶PPDK内含子相连，以35S为启动子，OCS终止子,如图2所示。
[0007]本发明还保护了所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列在甘蔗转基因中的应用。
[0008]本发明还提供了一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，所述载体的T-DNA区结构(如图1所示)为:右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因，其中正向双价抗病序列即甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。其中内含子为丙酮酸磷酸双激酶PPDK内含子。
[0009]所述抗虫基因为基因。
[0010]所述抗除早剂基因为ife/"基因。
[0011]所述载体的构建如 下:
(1)将甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的保守区融合在一起，形成正向双价抗病序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示；
(2)将步骤(1)所得融合基因以反向重复的方式与内含子相连，构建甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构，结构为35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子；
(3)构建含步骤(1)所述融合基因、βτ以C基因和ifer基因的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，T-DNA区结构为:右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因。
[0012]本发明还保护了所述的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体在甘蔗转基因中的应用。
[0013]本发明的优点在于:
(1)效率高:本发明的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体用于转化甘蔗植株，同一次转化中可获得同时具有4种抗性的转基因作物，与单一抗性的遗传转化相比，可以提高效率3倍以上；
(2)抗性表达好:双价抗病毒干扰序列采用35S启动子，Or以C基因采用Ubi启动子，ifer基因采用NOS启动子；3种不同性质的基因(干扰序列)分别采用不同的启动子启动，有利于每一种基因(干扰序列)表达框各自表达；
(3)转基因安全性高:本发明的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体用于转化甘蔗，获得的转基因植株没有抗生素抗性基因，可提高转基因甘蔗的安全性。【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为T-DNA区结构图:图中“-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子为双价抗病干扰序列结构表达框；“_Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子_，，为抗虫基因C表达框；“_N0S启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-，，为抗除草剂ifer基因表达框；”右边界、左边界”为TDNA插入结构的左右边界。
[0015]图2为双价干扰结构。
[0016]图3为抗病虫和除草剂四价植物干扰表达载体pART27-MYCP_CrylAC的物理图谱。
[0017]图4A为抗性再生植株fer基因PCR检测电泳图，泳道中1_20为抗性再生植株PCR结果，WT为非转基因阴性对照，P为质粒阳性对照，CK为空白对照水。
[0018]图4B为fer基因阳性植株基因PCR检测电泳图，泳道中1_20为fer基因检测阳性植株，WT为非转基因阴性对照，P为质粒阳性对照，CK为空白对照水。
[0019]图4C为fer基因阳性植株MYCPf序列PCR检测电泳图，泳道中1_20为fer基因检测阳性植株，与图4B各泳道对应，WT为非转基因阴性对照，P为质粒阳性对照，CK为空白对照水。
图4D为fer基因阳性植株MYCPr序列PCR检测电泳图，泳道中1_20为fer基因检测阳性植株，与图4B、图4C各泳道对应，WT为非转基因阴性对照，P为质粒阳性对照，CK为空白对照水。
[0020]图5为四价转基因甘蔗植株Bt蛋白表达试纸检测，图中Tl、T4、T10、T13、T18为四价转基因甘蔗植株GMFNl5，WT为非转基因甘蔗植株FN15。图中箭头处为Bt蛋白试纸检测阳性条带。
【具体实施方式】
[0021]为了充分公开本发明一种培育无抗生素四价抗病虫和除草剂转基因甘蔗植株的方法，以下结合实施例加以说明。
[0022]实施例中使用的质粒pUBCG0229_CrylAc (含Ub1-βτ以C_N0S表达框)由农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室改造[基因枪法获得转基因甘蔗的研究，热带亚热带植物学报，2011，19(2): 142-148]、质粒 pGreen II 0229、pHANNIBAL 和 pART27 均由中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心提供；中间载体pHANNIBAL-Z和表达载体pART27_Z由福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室改造保存。其中，中间载体 pHANNIBAL-Z:用 Sphl 和 SpeI 同时酶切 `pGreen II 0229 (含 NOSp-fer-NOS 表达框)和pHANNIBAL，并分别回收1050 bp和5812 bp片段，经T4DNA酶16°C过夜连接而成，在Sphl和分el位点之间引入Sma I酶位点；表达载体pART27-Z (将筛选基因MT //换成Bar):用设计的在5’端加及? H I酶切位点和3’ MBsplW I酶切位点的克隆Sar基因引物Bar-F: 5’-GCGGATCCCGATCTCAGATCTCGGTGAC-3’ ， Bar-R: 5’-GATTCGAAAACGACGCCCGGCCGACATC-3从质粒pGreen II 0229 (含NOSp-fer-NOS表达框)上克隆fer基因，以这两种酶消化质粒PART27回收11667 bp，酶切克隆的fer基因回收553 bp，经T4DNA酶16 1:过夜连接而成。克隆载体pMD19_T购自Takara公司。
[0023]实施例中使用的主要试剂:限制性酶内切酶购自Fermentas公司；E.Z.N.A.?GelExtraction Kit (D2500_02)、E.Ζ.N.A.?Plasmid Mini Kit (D6942-02)购自 OMEGA 公司；Trizol购自上海生工生物技术有限公司；T4 DNA Ligase和大肠杆菌感受态购自北京天根生化科技有限公司；Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit (BSC13S1)购自杭州博日科技有限公司产品.’Premix Taq? (RR902A)和反转录试剂盒购自TaKaRa公司，SYBR? Select Master Mix购自ABI公司；BT_CrylAb/lAC抗虫检测试条(25T)购自上海佑隆生物科技公司。
[0024]甘蔗ScMV-CP基因(423bp)和ScYLV-CP基因(230bp)保守序列:由上海生工生物技术公司合成。
[0025]PCR引物设计:采用生物学软件Primer Premier 5.0设计特异性引物。对收集的甘蔗ScMV-CP基因序列和ScYLV-CP基因序列进行BLAST比对，根据获得的甘蔗ScMV-CP基因(423bp)和K-CF基因(230bp)保守序列分别设计克隆甘蔗基因保守序列的引物sMCP，上游引物添加内切酶CZa I (ATCGAT)和I (GAATTC)位点，下游引物添加内切酶油a I (TCTAGA)位点，设计克隆甘蔗基因保守序列的引物sYCP，上游引物添加内切酶油a I (TCTAGA)位点，下游引物添加内切酶历III (AAGCTT)和沿ο I(CTCGAG)位点，通过酶切连接将两个片段连接起来，获得的新序列命名为MYCP，根据MYCP序列设计检测引物sMYCP ;同时根据RNAi中间载体pHANNIBAL-Z插入区的启动子CaMV35S和插入的正向序列MYCPf设计正向检测引物sMYCPf，根据终止子OCS和插入的反向序列MYCPr设计反向检测引物sMYCPr ;而检测^基因的引物和程序参考农业部1485号公告-11-2010，引物命名为sBt ;检测fer基因的引物和程序参考出入境检验检疫行业标准SN/T1202-2003，引物命名为 sBar (表 I)。
[0026]表1引物序列及片段大小
【权利要求】
1.一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，是由甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的保守序列融合而成，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一种甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构，是将权利要求1所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列以反向重复的方式与丙酮酸磷酸双激酶PPDK内含子相连，以35S为启动子，OCS终止子。
3.权利要求1所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列在甘蔗转基因中的应用。
4.权利要求2所述的甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构在甘蔗转基因中的应用。
5.一种无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，其特征在于:所述载体的T-DNA区结构为:右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因，其中正向双价抗病序列即甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示。
6.根据权利要求5所述的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，其特征在于:所述抗虫基因为基因。
7.根据权利要求5所述的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，其特征在于:所述抗除草剂基因为ifer基因。
8.根据权利要求5所述的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，其特征在于:所述载体的构建如下: (1)将甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因和甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因的保守区融合在一起，形成正向双价抗病序列，其DNA序列如SEQ ID N0.1所示； (2)将步骤(1)所得融合基因以反向重复的方式与内含子相连，构建甘蔗花叶病毒和甘蔗黄叶病毒双价干扰结构，结构为35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子； (3)构建含步骤(1)所述融合基因、βτ以C基因和ifer基因的无抗生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体，T-DNA区结构为:右边界-35S启动子-正向双价抗病序列-内含子-反向双价抗病序列-OCS终止子-Ubi启动子-抗虫基因-NOS终止子-NOS启动子-抗除草剂基因-NOS终止子-左边界，T-DNA区左右边界内无抗生素基因。
9.权利要求5所述的无抗 生素四价抗病虫和除草剂植物表达载体在甘蔗转基因中的应用。
【文档编号】C12N15/62GK103805620SQ201310715572
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月23日 优先权日:2013年12月23日
【发明者】陈平华, 张卓, 陈忠伟, 王恒波, 施桂姣, 项慰, 刘迪, 邰连赛, 高世武, 林冰, 陈利平, 陈容, 高三基, 许莉萍, 陈如凯 申请人:福建农林大学