一种玫烟色棒束孢菌株的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种玫烟色棒束孢菌株（Isariafumosorosea）。该菌株是从江西九连山国家级自然保护区被虫生真菌自然侵染的家白蚁虫体上分离获得的野生菌株，将野生菌株回接于家白蚁虫体上复壮获得本发明玫烟色棒束孢菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。该纯化菌株为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，于2013年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013526。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，表明该菌株在小菜蛾和家白蚁生物防治中具有非常强的应用潜力。
【专利说明】一种玫烟色棒束孢菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】。更具体地，涉及一种玫烟色棒束孢菌株。
【背景技术】
[0002]昆虫病原真菌是杀虫微生物的重要组成部分，约占昆虫病原微生物种类的60%以上。微生物农药的大量开发利用可有效降低和消除目前化学农药普遍存在的残留、毒性和抗药性等诸多负面作用。玫烟色棒束孢(/saria /i/fflosoriosea)是一种重要的昆虫病原真菌，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，能寄生包括同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目和膜翅目等多种蔬菜、果树及茶树害虫。玫烟色棒束孢对害虫高效、对环境友好、不易产生抗药性等优点，因此成为国内外生物防治研究的热点。用真菌微生物农药防治植物病虫害是无公害农产品可持续生产中的重要手段之一，具有广阔的应用前景。
[0003]玫烟色棒束孢作为一种常见的昆虫病原真菌应用于害虫防治，其生长发育受多种生态因子影响，对寄主昆虫的致病过程复杂，并涉及多种基因及其产物的调控，实践应用防效不稳定，限制了其应用。菌株改良虽可提高毒力并扩大其应用范围，但仍存在很多待解决或未知的问题。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有玫烟色棒束孢菌株防治害虫效果差及防效不稳定等缺陷和技术不足，提供一种玫烟色棒束孢菌株。
[0005]本发明目的是提供上述玫烟色棒束孢菌株及其培养方法。
[0006]本发明上述目的通过`以下技术方案实现:
本发明提供了一种玫烟色棒束孢菌株，所述菌株为玫烟色棒束孢(hariafumosorosea (Wize) Brown & Smith)菌株 SCAU-1FCF02,该菌株于 2013 年 11 月 I 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
[0007]所述玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02属丝孢目、棒束孢属。
[0008]所述玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的形态学特征描述如下:
菌落形态:菌落正面绒毛状，初白色，产孢后呈淡玫烟色，凹凸蓬松粉层；背面乳黄色，中心至边缘半径15mm圆内多条丘状隆起。
[0009]菌丝和孢子形态:通过显微观察，可以看到分生孢子梗着生在营养菌丝上。菌丝分隔，透明，光滑，宽1.5~2.5Mm。分生孢子梗单生或者聚集成孢梗束，100X 1.5~100X2.0Mm，壁光滑，透明，大多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7~8.0X 1.0~2.0Mm。分生孢子球形至近梭形,光滑，透明至微淡红色，3.0~4.0X1.0~2.0Mm,无厚垣孢子。
[0010]本发明获得玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的步骤如下:
S1.采样:从江西九连山国家级自然保护区采取被虫生真菌自然侵染的家白蚁；52.分离:从采回的被虫生真菌感染的家白蚁虫尸样品上分离病原菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板中，置于25土 1°C恒温培养箱中培养,待菌落形成后,转移到PDA斜面，再转入4°C冰箱内保存；
53.复壮:将分离到的菌株在PDA平板上培养15天，待形成菌落后加入含有0.03%吐温-80的无菌水洗下孢子，然后移入烧杯中，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌30分钟，稀释为IX IO7个孢子/mL的孢子悬浮液，用小型手动喷雾器均匀喷于家白蚁工蚁体表，保湿90%~100%，7 d后挑取感染的家白蚁，按照前面所述的方法分离得到A分离株；
54.纯化:A分离株在PDA平板上培养15d，待形成玫烟色孢子后，挑取分生孢子制成
IX IO3个孢子/mL的孢子悬浮液，将悬浮液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，置于培养箱中培养，获得B、C、D、E、F共5个分尚株；
55.鉴定:根据病原菌的培养形状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定；
56.筛选:分别测定5个分离株对靶标害虫的致病力、菌株产孢量、孢子萌发率和菌落生长速率，比较结果筛选出活性强、对害虫防效最好的玫烟色棒束孢菌株。经美国农业部欧洲生物防治实验室昆虫病理学专家Guy Mecardier鉴定为Jsaria fumosorosea (Wize)Brown & Smith，菌株命名为SCAU-1FCF02，于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
[0011]本发明所用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)配方为:200g马铃薯，17~20g琼脂，20g葡萄糖，1000mL水,分装,高压灭菌锅灭菌(121°C, 30min)。
`[0012]虫生真菌在遗传、生态及生物学特性方面具有多样性，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力存在着显著的差异，菌株不同，其LD5(1、LT5tl可相差数倍甚至数十倍。筛选和获得高产孢量、孢子萌发率高和致病力强的优质菌株，是取得良好防治效果的前提和必要环节。在已报道的对小菜蛾毒力比较强的病原真菌中，球孢白僵菌CS-1在处理浓度为IXlO5孢子/ml时，在温室条件下对小菜蛾2龄幼虫的LT5tl为3.61天(Yoon et al.,1999);绿僵菌在处理浓度为I X IO8孢子/ml时，小菜蛾2龄幼虫的LT5tl为4.97天，对小菜蛾 2 龄幼虫的 LC5tl 为 2.03 X IO4 孢子/ml (Ma，2000)。
[0013]菌株筛选常用的4个指标分别是菌株对靶标害虫的致病力、菌株产孢量、孢子萌发率和菌落生长速率。本发明以上述指标为依据，筛选得到玫烟色棒束孢的优良菌株SCAU-1FCF02。接种玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02后第2天，各处理中2龄幼虫均开始发病死亡，表明所述菌株对小菜蛾具有非常强的致病力。在最高浓度I X IO7个孢子/mL时，小菜蛾2、3和4龄幼虫的累计校正死亡率分别为100%,98.93%,87.23%。在小菜蛾2、3和4龄幼虫接种后第7天，致死中浓度LC50分别为7.63 X IO3个孢子/mL、1.05 X IO4个孢子/mL和2.40 X IO4个孢子/mL。接种玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02后小菜蛾2、3和4龄幼虫的LC50分别为7.63X 103、1.05X 104、2.40父104个孢子/11^。在处理浓度为I X IO7个孢子/mL时，2、3和4龄幼虫的LT50分别为1.61天、1.66天和1.80天。相比于目前常用的玫烟色棒束孢菌株，本发明所述玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株对小菜蛾幼虫具有显著的高致病力，这从其对小菜蛾的致死中浓度和致死中时两方面均可以表现出来。玫烟色棒束孢SCAU-1FCF02菌株是目前为止所报道的对小菜蛾幼虫具最低的致死浓度和最快的致死速度的昆虫病原真菌，表现出该菌株在小菜蛾生物防治中具有较强的应用潜力。
[0014]本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，该菌株能够防治十字花科蔬菜害虫，尤其是对家白蚁和小菜蛾的防治效果非常显著，是目前为止所报道的对小菜蛾幼虫致死浓度最低和致死速度最快的昆虫病原真菌，在家白蚁和小菜蛾生物防治中具有较强的应用潜力。
[0015]另外，玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理，对环境无污染、无残留，对人类和家畜安全，适应了有机食品生产的要求；且该菌株是从江西九连山国家级自然保护区被侵染的家白蚁虫体上分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。在家白蚁和小菜蛾等十字花科蔬菜害虫的生物防治中具有很强的推广应用价值。
【具体实施方式】
[0016]以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本【技术领域】常规试剂、方法和设备。
[0017]除非特别说明，本发明所用试剂均为常规方法配制或市购，玫烟色棒束孢菌株的培养均按照本领域常规方法进行培养。
[0018]实施例中所用的含有0.03%吐温-80的无菌水，所述的0.03%指的是体积比。
[0019]实施例1玫烟色棒束孢菌株SCAU_IFCR)2的获得
1、实验材料和条件
(I)在江西九连山国家级自然`保护区采集到一种被虫生真菌侵染的家白蚁(Cop to termes formosanus ) 尸3。
[0020](2)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):200g马铃薯，17~20g琼脂，20g葡萄糖，1000mL水,分装,高压灭菌锅灭菌(121°C, 30min)。
[0021](3)无菌操作条件:所有器皿和用具均须经高压灭菌锅灭菌(121°C，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
[0022](4)菌株培养条件:置于25± 1°C光照恒温箱(14L: 10D)中培养,待菌落形成后,转移到PDA斜面，再转入4°C冰箱内保存。
[0023]2、病原菌的分离与鉴定
(I)分离:从采回的被虫生真菌感染的家白蚁虫尸样品上分离病原菌。利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入PDA平板中，置于25±1°C恒温培养箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4°C冰箱内保存。
[0024](2)复壮:将分离到的菌株在PDA平板上培养15天，待形成菌落后用含有0.03%吐温-80的无菌水洗下孢子，获得孢子悬浮液，移入烧杯中，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌30分钟，稀释为IX IO7个孢子/mL的孢子悬浮液，用小型手动喷雾器均匀喷于家白蚁工蚁体表，保湿90%~100%，7d后挑取感染的家白蚁，按照(I)所述的方法分离得到A分离株。
[0025](3)纯化:对A分离株分别在PDA平板上培养15d，待形成玫烟色孢子后，挑取分生孢子制成IXlO3个孢子/mL的孢子悬浮液，将悬浮液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，置于培养箱中培养，获得B、C、D、E、F共5个分离株。
[0026](4)鉴定:根据病原菌的培养形状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。
[0027]菌落形态描述:菌落正面绒毛状，初白色，产孢后呈淡玫烟色，凹凸蓬松粉层；背面乳黄色，中心至边缘半径15_圆内多条丘状隆起。
[0028]菌丝和孢子形态描述:通过显微观察，可以看到分生孢子梗着生在营养菌丝上。菌丝分隔，透明，光滑，宽1.5~2.5Mm。分生孢子梗单生或者聚集成孢梗束，100X1.5~100X2.0Mm,壁光滑，透明，大多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7~8.0X 1.0~2.0Mm。分生孢子球形至近梭形,光滑，透明至微淡红色，3.0~4.0X1.0~2.0Mm,无厚垣孢子。
[0029]3、玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的筛选
虫生真菌在遗传、生态及生物学特性方面具有多样性，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力存在着显著的差异，菌株不同，其LD5(1、LT5tl可相差数倍甚至数十倍。筛选和获得高产孢量、孢子萌发率高和致病力强的优质菌株，是取得良好防治效果的前提和必要环节。菌株筛选常用的4个指标分别是菌株对靶标害虫的致病力、菌株产孢量、孢子萌发率和菌落生长速率。本发明以上述指标为依据，筛选玫烟色棒束孢的优良菌株。
[0030]( I)供试菌株的处理
经纯化后获得的玫烟色棒束孢B、C、D、E、F共5个分离株，在PDA平板上于25± I °〇的恒温箱(光照周期为光照:黑暗=14:10)中培养。
[0031](2)供试虫源` 家白蚁采自华南农业大学校园，室内利用松木块饲养工蚁和白蚁，实验挑取健康的工蚁供室内毒力测定。
[0032](3)菌落生长速率和产孢量的测定
将5个分离株分别配制成I X IO7个孢子/mL的分生孢子悬浮液，分别取500μ?悬浮液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待2~3d长出菌丝后用直径为5mm的打孔器钻取新鲜菌落，并接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养(14L:10D)。每菌株5个重复。每2天定时定方向测量菌落直径的增长量，共测4次，计算生长速率(mm/天)。继续培养至第15d，测定各菌株的产孢量。具体操作如下:用直径13_的灭菌打孔器在菌落中心至边缘1/2处打孔取样，样品放入IOmL含有0.03%吐温-80的无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子分散均匀，制成孢子悬浮液，用血球计数板计数测定产孢量。结果如表1所示。
[0033](4)孢子萌发率的测定
将5个分离株分别培养15d后，用含有0.03%吐温-80的无菌水收集孢子并制成悬浮液(每视野内100个左右分生孢子)，用载玻片萌发法试验，将孢子悬浮液直接滴在无菌载玻片上，置于底部铺有灭菌滤纸的培养皿内，在皿内滴加4~5滴无菌水以保持100%的相对湿度(RH)，培养18h后镜检。每个处理5个重复。结果如表1所示。
[0034](5)分离株对家白蚁工蚁的致病力测定。
[0035]制备各供试菌株的孢子悬浮液:将各供试菌株接种于PDA平板上培养15d，用含有
0.03%吐温-80的无菌水洗下孢子，用磁力搅拌器搅拌30min，双层灭菌纱布滤去菌丝，制成孢子悬浮液，并用血球计数板调整孢子浓度为I X IO7个孢子/mL。[0036]试虫处理:采用浸虫法测定各分离株对家白蚁工蚁的致病力。选取健康的工蚁，用软镊子将供试工蚁挑入各分离株孢子悬浮液的稀释液(用含有0.03%吐温-80的无菌水进行稀释)中，浸溃IOs后挑出，将工蚁置于灭菌的滤纸上吸干多余水分后，移至底部衬有湿润滤纸的培养皿(直径为9cm)内，培养皿用保鲜膜封口，在薄膜上扎孔通气，每个处理20头工蚁，重复5次，共100头工蚁。另以含有0.03%吐温-80的无菌水作为对照，操作方法同上，重复5次。接种后，将各处理置于人工智能箱中内，25± I°C，相对湿度90%，光照周期为光照:黑暗=14:10。12小时后开始观察，用滤纸饲养处理的工蚁，视皿内滤纸被取食情况更换新鲜的滤纸。记录工蚁感病症状和死亡虫数，共计录7天。统计校正死亡率。结果如表I所示。
[0037](6)玫烟色棒束孢分离株的筛选
在筛选优良分离株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落平均生长速率次之。在本发明中，从表1可以看出，菌株B的菌落平均生长速率显著高于其余菌株，B菌株的菌落生长速率最快，为15.79mm/天，并且菌株B的产孢量在5个分菌株中也是最高的，达到2.71 X IO7个孢子/mL。菌株D次之为2.32 X IO7个孢子/mL。在孢子萌发率方面，各分离株孢子萌发率差异显著，其中以菌株B和C孢子萌发率最高为92.11%和90.39%。生测结果显示:菌株B感染家白蚁的校正死亡率最高，达到100%，显示出超强的致病力。
[0038]表1菌株生物学特性及其对家白蚁工蚁的校正死亡率
【权利要求】
1.一种玫烟色棒束孢菌株(/saria /i/fflosariosea),其特征在于,所述菌株为玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02，该菌株于2013年11月I日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO:M 2013526。
2.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢菌株(/saria/i/fflosariosea),其特征在于,所述的玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02属丝孢目、棒束孢属。
3.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢菌株(/saria/i/fflosariosea),其特征在于,所述的玫烟色棒束孢菌株SCAU-1FCF02的形态学特征描述如下: 菌落正面绒毛状，初白色，产孢后呈淡玫烟色，凹凸蓬松粉层；背面乳黄色，中心至边缘半径15mm的圆内有多条丘状隆起； 菌丝分隔，透明，光滑，宽1.5~2.5Mm； 分生孢子梗单生或者聚集成孢梗束，100X1.5~100X2.0Mm，壁光滑，透明，大多由着生4~6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成；瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7 ~8.0 X 1.0 ~2.0Mm ； 分生孢子球形至近梭形，光滑，透明至微淡红色，3.0~4.0X 1.0~2.0Mm,无厚垣孢子。
4.权利要求1、2或3所述的玫烟色棒束孢菌株的分离方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.采样:从江西九连山国家级自然保护区采取被虫生真菌自然侵染的家白蚁； 52.分离:从采回的被虫生真菌感染的家白蚁虫尸样品上分离病原菌，利用5%的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤，并放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板中，置于25°C恒温培养箱中培养，待菌落形成后，转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板斜面，冷藏保存； 53.复壮:将分离到的菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待形成菌落后加入含有0.03%吐温-80的无菌水洗下孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌30分钟后，稀释为I X IO7个孢子/mL的孢子悬浮液，均匀喷于家白蚁工蚁体表，保湿90%~100%，7 d后挑取感染的家白蚁，按照S2所述的方法分离得到A分离株； 54.纯化:A分离株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上培养，待形成玫烟色孢子后，挑取分生孢子制成IXlO3个孢子/mL的孢子悬浮液，将悬浮液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，置于培养箱中培养，获得B、C、D、E、F共5个分离株； 55.鉴定:根据病原菌的培养形状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定； 56.筛选:分别测定5个分离株对靶标害虫的致病力、菌株产孢量、孢子萌发率和菌落生长速率，比较结果筛选出活性强、对害虫防效最好的玫烟色棒束孢菌株，即玫烟色棒束孢菌株 SCAU-1FCF02。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制方法为:0.2g/mL的马铃薯，0.017~0.02g/mL的琼脂，0.02g/mL的葡萄糖，加水定容，分装，121°C灭菌。
【文档编号】C12N1/14GK103756913SQ201310721109
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】何余容, 吕利华, 念晓歌 申请人:华南农业大学