一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒以及检测方法。本发明提供的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针不需要任何的标记和修饰，设计简单。而且本发明将甲基化酶和特定的依赖甲基化的内切酶的作为组合使用，只有两者的相互作用才能将发卡结构的检测探针切开，产生引物信号，从而产生化学发光信号；而任何其他甲基化酶作用发卡结构后都不能被该组合之外的内切酶识别，不能产生引物信号，从而没有化学发光信号，使本发明的特异性非常高。此外，本发明的技术方案将连接酶催化效率高与化学发光信号显著增强的两种优势串联起来，极大地提高了检测灵敏度。本发明在疾病早期诊断和药物筛选方面具有广阔的应用价值。
【专利说明】一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子检测领域，具体涉及一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]甲基化酶(如Dam甲基化酶、Dcm甲基化酶、EcoK I甲基化酶、Sss I甲基化酶)已经成为包括癌症在内的众多疾病早期诊断的重要生物标志物，但它们在细胞内的含量较低，因而对甲基化酶进行高灵敏分析具有很大的挑战性。
[0003]现有的甲基化酶检测技术主要包括高效液相色谱技术(HPLC)，放射性标记技术，金纳米比色检测法和荧光检测法。高效液相色谱技术需要消耗巨大的物力与人力；放射性标记技术常需要引入放射性元素，不安全；金纳米颗粒预处理操作复杂，耗时长；荧光检测常存在灵敏度低的缺点。
[0004]因此，有必要提供一种成本低、简单易行、且能快速、高灵敏地检测甲基化酶的方法。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针。本发明第二方面提供了一`种基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒。本发明第三方面提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测方法。本发明第四方面提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测方法，用于检测待测样品中基化酶的浓度C。本发明提供的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针不需要任何的标记和修饰，本发明提供的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒采用的试剂成本低，本发明提供的基于化学发光反应的甲基化酶检测方法具有很高的灵敏度和特异性，本发明提供的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒和检测方法在疾病早期诊断和药物筛选方面具有广阔的应用价值。
[0006]本发明所述的片段A为单链脱氧核苷酸。
[0007]第一方面，本发明提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，所述检测探针包括发卡探针、引物-1和引物_2，所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎_2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (1)，所述双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~Sbp ;
[0008]所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。[0009]优选地，所述发卡探针的双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn I内切酶。[0010]具体的，所述Dam甲基化酶的识别位点为GATC，；所述依赖甲基化的内切酶为DpnI内切酶的识别位点为G*ATC，其中G*ATC即为Dpn I酶切位点；在S-腺苷甲硫氨酸(Sam)存在时，Dam甲基化酶在其识别位点GATC的A碱基上加上一个甲基形成G*ATC，即Dpn I酶切位点。
[0011]即在该优选条件下，被甲基化修饰后的发卡探针能被依赖甲基化的内切酶识别，并被切断。被切断后的发卡探针产生一个小的发卡结构和小段的双链DNA，由于小发卡结构退火温度过低，即打开为一条单链的DNA，该单链DNA能与引物-1的部分序列互补配对。
[0012]将本发明提供的引物-1和引物-2混合，用环形探针连接试剂处理，可得到环形探针。
[0013]优选地，所述环形探针连接试剂包括:1XT4连接酶缓冲液(6.6毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升二硫苏糖醇，0.1毫摩尔每升的三磷酸腺苷，66毫摩尔每升的三异丙基乙磺酰盐酸)、Τ4连接酶、ΡΗ7.9的外切酶混合物(I毫摩尔每升的二硫苏糖醇、6.7毫摩尔每升的氯化镁、67毫摩尔每升甘氨酸-氢氧化钾、10个单位外切酶1、20个单位外切酶III)。
[0014]优选地，所述处理方式为:取I微摩尔每升的引物-1及I微摩尔每升的引物-2加入I X Τ4连接酶缓冲液中，在95度加热5分钟使得两种引物DNA变性，再缓慢降温至37度；再加入50个单位的Τ4连接酶后16度过夜反应；连接反应后，将10微升的反应产物加入到10微升的外切酶混合物中进行消化反应，得到所述环形探针。
[0015]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0016]优选地，所述片段A的序列为如SEQ ID Ν0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0017]具体地，所述SEQ ID Ν0:1 为 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0018]在此优选条件下，
[0019]所述片段A 的序列为 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID Ν0:6)；
[0020]所述SEQ ID NO:2 为 GGGTGGGTGGGTGGGT，
[0021]在此优选条件下，
[0022]所述片段A 的序列为 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID NO: 7);
[0023]所述SEQ ID NO:3 为 GTGGGTAGGGCGGGTTGG，
[0024]在此优选条件下，
[0025]所述片段A 的序列为 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID Ν0:8)；
[0026]所述SEQ ID NO:4 为 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0027]在此优选条件下，
[0028]所述片段A 的序列为 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID Ν0:9)；
[0029]所述SEQ ID NO:5 为 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0030]在此优选条件下，
[0031]所述片段A 的序列为 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。[0032]具体地，所述SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5的序列可形成分子内平行型G-四链体，该G-四链体可与氯高铁血红素(hemin)结合形成血红素-G四聚体，该血红素-G四聚体是一种DNA过氧化物酶，具有过氧化物酶的催化作用，其在鲁米诺和过氧化氢存在条件下，可催化3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)等发光试剂发生氧化反应并产生化学发光信号；此外，还可催化其他氧化还原发光底物发生氧化还原反应并产生颜色的变化，如硝酸双-N-甲基吖啶翁(光泽精，又称N，N 二甲基二吖啶硝酸盐)、2，4，5-三苯基咪唑(洛粉碱)、3，4，5-三羟基苯甲酸(没食子酸)、双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐(过氧草酸盐)或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)。
[0033]优选地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。
[0034]本发明发卡探针经依赖甲基化的内切酶切割所得的单链DNA与所述环形探针的部分序列互补配对后，在聚合酶作用下，以环形探针为扩增模板进行滚环反应；同时，由于环形探针中具有DNA酶序列，所述5’端或3’端的切刻内切酶，因而在切刻酶的作用下，滚环反应不断的进行延伸产生的DNA酶序列能被切刻酶不断切割，得到的切割片段又可以作为新的滚环扩增反应的引物，如此产生大量的短的DNA酶片段，这些DNA酶片段能与hemin结合形成具有过氧化物酶催化活性的G-四聚体，能够催化过氧化氢与发光底物如3-氨基邻苯二甲酰肼、硝酸双-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羟基苯甲酸、双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ATBS)进行氧化还原反应，产生化学发光信号。
[0035]本发明通过不断产生引物的滚环扩增方式产生了大量的短的DNA酶片段，再利用DNA酶能与hemin结合形成过氧化物酶催化活性的G-四聚体，将这两步反应串联在一起，使化学发光信号指数级扩大 ，极大地放大了目标信号，从而能够高灵敏度地检测甲基化酶。
[0036]优选地，所述引物-2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 11所示。
[0037]优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0038]优选地，所述引物-1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 13所示。
[0039]第二方面，本发明提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，包括:
[0040]发卡探针、引物-1、引物_2、发卡探针甲基化试剂、依赖甲基化的内切酶酶切试剂、环形探针连接试剂、滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂、DNA酶检测试剂，
[0041]其中，所述依赖甲基化的内切酶酶切试剂包括依赖甲基化的内切酶，所述环形探针连接试剂包括DNA连接酶和DNA外切酶，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂包括DNA聚合酶和切刻内切酶，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
[0042]所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎_2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (I )，所述双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ;
[0043]所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。
[0044]优选地，发卡探针的甲基化试剂包括:160微摩尔每升的S-腺苷甲硫氨酸(Sam)、IX甲基化酶反应缓冲液(0.05摩尔每升的三异丙基乙磺酰盐酸，pH7.5，0.01摩尔每升的氯化纳，0.01摩尔每升的乙二胺四乙酸，5毫摩尔每升的2-巯基乙醇)，其中，所述发卡探针优选为2微摩尔每升。
[0045]在此优选情况下，本发明提供的发卡探针的甲基化条件优选为:取适量浓度的甲基化酶待测样品，加入发卡探针和发卡探针的甲基化试剂，37度孵育2小时后再65度反应10分钟使酶失活，即得到甲基化后的发卡探针。
[0046]优选地，依赖甲基化的内切酶的酶切试剂还包括:1XNEB缓冲液4 (50毫摩尔醋酸钾，20毫摩尔的三异丙基乙磺酰乙酸，10毫摩尔醋酸镁，I毫摩尔的二硫苏糖醇，PH7.9)，其中，所述依赖甲基化的内切酶优选为10单位每微升。
[0047]在此优选情况下，采用所述依赖甲基化的内切酶对甲基化后的发卡探针进行反应的条件优选为:将甲基化反应产物与依赖甲基化的内切酶的酶切试剂按体积比1:3混合，37度孵育一个半小时，然后再80度反应20分钟使酶失活。
[0048]优选地，所述环形探针连接试剂还包括:1XT4DNA连接酶缓冲液(6.6毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升二硫苏糖醇，0.1毫摩尔每升的三磷酸腺苷，66毫摩尔每升的三异丙基乙磺酰盐酸)、PH7.9的外切酶缓冲液(I毫摩尔每升的二硫苏糖醇、6.7毫摩尔每升的氯化镁、67毫摩尔每升甘氨酸-氢氧化钾)，其中，所述DNA连接酶优选为T4DNA连接酶，所述DNA外切酶优选为包括外切酶I与外切酶III;所述外切酶I与外切酶III分别优选为I单位每微升与2单位每微升，所述引物-1和引物-2均优选为I微摩尔每升。
[0049]在此优选情况下，采用所述环形探针连接试剂制备环形探针的方式优选为:取I微摩尔每升的引物-1及I微摩尔每升的引物-2加入I XT4连接酶缓冲液中，在95度加热5分钟使得两种引物DNA变性，再缓慢降温至37度；再加入50个单位的T4连接酶后16度过夜反应；连接反应后，将10微升的反应产物加入到10微升的外切酶混合物中进行消化反应，得到所述环形探针。
[0050]优选地，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂还包括:30纳摩尔每升的环形探针(采用本发明提供的环形探针连接试剂所制备)、20毫摩尔每升三异丙基乙磺酰盐酸(PH8.8),10毫摩尔每升的硫酸铵、10毫摩尔每升的氯化钾、6毫摩尔每升的硫酸镁、400微摩尔每升的dNTPs (四种脱氧核糖核苷酸的混合物)、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，其中，所述DNA聚合酶和切刻内切酶分别优选为0.08单位每微升和0.13单位每微升。
[0051]进一步优选地，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exc^DNA 聚合酶。
[0052]进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。
[0053]在此优选情况下，采用所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂进行反应的方式优选为:取体积比为1:19的发卡探针酶切产物和所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂混合，60度孵育90分钟。
[0054]优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括:105微升含有0.5毫摩尔每升的鲁米诺、15微升的去离子水、75微升2XHEPES缓冲液(40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、PH8.0)。
[0055]在此优选条件下，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素(hemin)优选为75纳摩尔每升，采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为:将15微升的滚换扩增以及切刻内切酶酶切产物加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
[0056]优选地，所述发卡探针的双链DNA (1)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn I内切酶。
[0057]进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂中所述的鲁米诺还可替换为硝酸双-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羟基苯甲酸、双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)。
[0058]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0059]优选地，所述片段A的序列为如SEQ ID N0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0060]具体地，所述SEQ ID NO:1 为 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0061]在此优选条件下，
[0062]所述片段A 的序列为 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID N0:6)；
[0063]所述SEQ ID NO:2 为 GGGTGGGTGGGTGGGT,
[0064]在此优选条件下，
[0065]所述片段A 的序列为 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID NO: 7);
[0066]所述SEQ ID NO:3 为 GTGGGTAGGGCGGGTTGG,
[0067]在此优选条件下，
[0068]所述片段A 的序列为 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID N0:8)；
[0069]所述SEQ ID NO:4 为 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0070]在此优选条件下，
[0071]所述片段A 的序列为 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID N0:9)；
[0072]所述SEQ ID NO:5 为 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0073]在此优选条件下，
[0074]所述片段A 的序列为 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。
[0075]优选地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。
[0076]优选地，所述引物-2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 11所示。
[0077]优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0078]优选地，所述引物-1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 13所示。
[0079]本发明第三方面提供了一种基于DNA过氧化物酶的甲基化酶检测方法，包括如下步骤:[0080]I)提供发卡探针、引物-1、引物-2、发卡探针、引物-1、引物-2、发卡探针甲基化试剂、依赖甲基化的内切酶酶切试剂、环形探针连接试剂、滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂、DNA酶检测试剂，
[0081]其中，所述依赖甲基化的内切酶酶切试剂包括依赖甲基化的内切酶，所述环形探针连接试剂包括DNA连接酶和DNA外切酶，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂包括DNA聚合酶和切刻内切酶，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂；
[0082]所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎_2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (I)，所述双链DNA (I)具有Dam甲基化酶的识别位点以及所述Dpn I内切酶的酶切位点，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ;
[0083]所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补；及
[0084]2)取待测甲基化酶样品，加入所述发卡探针和发卡探针甲基化试剂进行甲基化反应，得到含甲基化的发卡探针产物 '及
[0085]3)将所得含 甲基化的发卡探针产物加入依赖甲基化的内切酶酶切试剂进行酶切反应，得到单链DNA，所述单链DNA与引物-1的部分序列互补；及
[0086]4)将引物-1和引物-2混合，用环形探针连接试剂进行退火、连接、酶切处理，得到环形探针 '及
[0087]5)取步骤3)所得的单链DNA和步骤4)所得的环形探针混合，加入滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂，进行滚环扩增和酶切反应，得到切刻内切酶的酶切产物；及
[0088]6)取所得切刻内切酶的酶切产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
[0089]优选地，发卡探针的甲基化试剂包括:160微摩尔每升的S-腺苷甲硫氨酸(Sam)、IX甲基化酶反应缓冲液(0.05摩尔每升的三异丙基乙磺酰盐酸，pH7.5，0.01摩尔每升的氯化纳，0.01摩尔每升的乙二胺四乙酸，5毫摩尔每升的2-巯基乙醇)，其中，所述发卡探针优选为2微摩尔每升。
[0090]在此优选条件下，在所述步骤(2 )中，所述发卡探针甲基化试剂处理待测甲基化酶样品的过程中，处理的条件为:取适量浓度的甲基化酶待测样品，加入发卡探针和发卡探针的甲基化试剂，37度孵育2小时后再65度反应10分钟使酶失活，即得到甲基化后的发卡探针。
[0091]优选地，依赖甲基化的内切酶的酶切试剂还包括:1XNEB缓冲液(50毫摩尔醋酸钾，20毫摩尔的三异丙基乙磺酰乙酸，10毫摩尔醋酸镁，I毫摩尔的二硫苏糖醇，PH7.9)，其中，所述依赖甲基化的内切酶优选为10单位每微升。
[0092]在此优选条件下，在所述步骤(3)中，将所得含甲基化的发卡探针产物加入依赖甲基化的内切酶酶切试剂进行酶切反应，得到单链DNA的过程中，处理的条件为:将甲基化反应产物与依赖甲基化的内切酶的酶切试剂按体积比1:3混合，37度孵育一个半小时，然后再80度反应20分钟使酶失活。
[0093]优选地，所述环形探针连接试剂还包括:1XT4DNA连接酶缓冲液(6.6毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升二硫苏糖醇，0.1毫摩尔每升的三磷酸腺苷，66毫摩尔每升的三异丙基乙磺酰盐酸)、PH7.9的外切酶缓冲液(I毫摩尔每升的二硫苏糖醇、6.7毫摩尔每升的氯化镁、67毫摩尔每升甘氨酸-氢氧化钾)，其中，所述DNA连接酶优选为T4DNA连接酶，所述DNA外切酶优选为包括外切酶I与外切酶III;所述外切酶I与外切酶III分别优选为I单位每微升与2单位每微升，所述引物-1和引物-2均优选为I微摩尔每升。
[0094]在此优选条件下，在所述步骤(4)中，将引物-1和引物-2混合，用环形探针连接试剂进行退火、连接、酶切处理，得到环形探针的过程中，处理的条件为:取I微摩尔每升的引物-1及I微摩尔每升的引物-2加入1XT4连接酶缓冲液中，在95度加热5分钟使得两种引物DNA变性，再缓慢降温至37度；再加入50个单位的T4连接酶后16度过夜反应；连接反应后，将10微升的反应产物加入到10微升的外切酶混合物中进行消化反应，得到所述环形探针。
[0095]优选地，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂还包括:30纳摩尔每升的环形探针(采用本发明提供的环形探针连接试剂所制备)、20毫摩尔每升三异丙基乙磺酰盐酸(PH8.8),10毫摩尔每升的硫酸铵、10毫摩尔每升的氯化钾、6毫摩尔每升的硫酸镁、400微摩尔每升的dNTPs (四种脱氧核糖核苷酸的混合物)、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚，其中，所述DNA聚合酶和切刻内切酶分别优选为0.08单位每微升和0.13单位每微升。
[0096]进一步优选地，所述DNA聚合酶为Phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段或VentR exc^DNA 聚合酶。
[0097]进一步优选地，所述切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.Bs`tNBI切刻内切酶。
[0098]在此优选条件下，在所述步骤(5)的过程中，处理的条件为:取体积比为1:19的发卡探针酶切产物和所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂混合，60度孵育90分钟。
[0099]优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括:105微升含有0.5毫摩尔每升的鲁米诺、15微升的去离子水、75微升2XHEPES缓冲液(40毫摩尔每升的HEPES、600毫摩尔氯化钠、PH8.0)。
[0100]优选地，在所述步骤(6)中，所述DNA酶检测试剂中的氯高铁血红素(hemin)优选为75纳摩尔每升。
[0101]在此优选条件下，在所述步骤(6)中，取所得切刻内切酶的酶切产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号的过程中，处理的条件为:采用所述DNA酶检测试剂进行检测的方式优选为:将15微升的滚换扩增以及切刻内切酶酶切产物加入到105微升的所述DNA酶检测试剂中得到混合物，将混合物放入GloMax96微型板块光度计检测化学发光的信号，使用自动加样的程序加入过氧化氢，时间间隔设置为1.5秒，得到化学发光信号。
[0102]进一步优选地，所述DNA过氧化物酶检测试剂中所述的鲁米诺还可替换为硝酸双-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羟基苯甲酸、双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐或2，2'-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)。
[0103]优选地，所述发卡探针的双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Taq I甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn I内切酶。
[0104]优选地，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 5任一所示的核苷酸序列。
[0105]优选地，所述片段A的序列为如SEQ ID N0:6~SEQ ID NO: 10任一所示的核苷酸序列。
[0106]具体地，所述SEQ ID N0:1 为 GGGTAGGGCGGGTTGGG，
[0107]在此优选条件下，
[0108]所述片段A 的序列为 CCCAACCCGCCCTACCC (SEQ ID N0:6)；
[0109]所述SEQ ID NO:2 为 GGGTGGGTGGGTGGGT，
[0110]在此优选条件下，
[0111]所述片段A 的序列为 ACCCACCCACCCACCC (SEQ ID N0:7)；
[0112]所述SEQ ID NO: 3 为 GTGGGTAGGGCGGGTTGG，
[0113]在此优选条件下，
[0114]所述片段A 的序列为 CCAACCCGCCCTACCCAC (SEQ ID N0:8)；
[0115]所述SEQ ID N0:4 为 GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG，
[0116]在此优选条件下，
[0117]所述片段A 的序列为 CCACACCCACCCACAATGACCCAC (SEQ ID N0:9)；
[0118]所述SEQ ID NO: 5 为 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG，
[0119]在此优选条件下，
[0120]所述片段A 的序列为 CCACCACCACCACAACCACCACCACC (SEQ ID NO: 10)。
[0121]优选地，所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。
[0122]优选地，所述引物-2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 11所示。
[0123]优选地，所述发卡探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
[0124]优选地，所述引物-1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 13所示。
[0125]第四方面，本发明提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测方法，用于检测待测样品中基化酶的浓度C，包括如下步骤:
[0126]将如第三方面所述的基于DNA过氧化物酶的甲基化酶检测方法所得的化学发光信号代入下式
[0127]Ic=147614.4+34572.31og10C
[0128]式中，Ic为所述化学发光信号的发光强度，所述浓度C为每毫升待测样品中含甲基化酶的单位数。
[0129]优选地，所述甲基化酶为Dam甲基化酶。
[0130]本发明提供基于化学发光反应的甲基化酶检测探针、检测试剂盒及检测方法具有如下有益效果:
[0131]1.发卡探针、引物-1和引物-2设计简单。本发明提供的发夹探针只要在颈结构上含有供甲基化酶识别的序列，不需要任何的修饰；引物-1只要包括切刻酶酶切位点、与发卡探针互补的位点，引物-2的序列即为引物-1两末端互补的序列，这使得探针易于设计，可行性强。[0132]2.特异性高。本技术方案将甲基化酶和特定的依赖甲基化的内切酶的作为组合使用，只有两者的相互作用才能将发卡结构切开，产生引物信号，从而产生化学发光信号；而任何其他甲基化酶作用发卡结构后都不能被该组合之外的内切酶识别，不能产生引物信号，从而没有化学发光信号，使本技术方案的特异性非常高。
[0133]3.灵敏度高。本发明的技术方案将连接酶催化效率高与化学发光信号显著增强的两种优势串联起来，极大地提高了检测灵敏度。
[0134]4.成本低。化学发光具有灵敏度高和线性范围广的特点，而且价格低廉，在生物医学研究和疾病诊断方面具有广阔的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0135]图1为本发明实施例1提供的发卡探针的结构示意图；
[0136]图2为本发明实施例2提供的基于DNA过氧化物酶的甲基化酶检测方法流程图；
[0137]图3为本发明实施例3提供的各浓度甲基化酶溶液的化学发光信号；
[0138]图4为本发明实施例3提供的不同浓度甲基化酶与化学发光强度的变化关系拟合曲线；
[0139]图5为本发明对比实施例1提供的样品的化学发光信号；
[0140]图6为本发明对比实施例2提供的甲基化酶和酶切实验的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果；
[0141]图7为本发明对比实施例2提供的样品的扩增反应实时荧光检测结果；
`[0142]图8为本发明对比实施例2提供的样品的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；
[0143]图9为本发明对比实施例2提供的样品的化学发光信号；
[0144]图10为本发明对比实施例3提供的5-氟尿嘧啶作为抑制剂进行实验结果。
【具体实施方式】
[0145]下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual K Sambrook, J., Russell, David ff., MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海生工合成。
[0146]实施例1
[0147]图1为本发明实施例提供的发卡探针的5’端侧链(茎-1)与3’端侧链(茎-2)互补形成双链I的结构示意图，该发卡探针包括双链I和环。其中，所述双链DNAl具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ;
[0148]结合图1，以Dam甲基化酶为例，本实施例提供了一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，包括如下步骤:
[0149](I)体外合成发卡探针，核苷酸序列(5，端到3，)如SEQ ID N0:12所示;
[0150](2)根据发卡探针的序列设计引物-1和引物_2，引物-1只要包括切刻酶酶切位点、与发卡探针互补的位点，引物-2的序列即为引物-1两末端互补的序列，所述引物-1和引物-2的核苷酸序列(5，端到3，)分别如SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 11所示；[0151]具体地，所述发卡探针、引物-1和引物-2的核苷酸序列如下表1所示:
[0152]表1.发卡探针、引物-1和引物-2的核苷酸序列
[0153]
【权利要求】
1.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述检测探针包括发卡探针、引物-1和引物-2，所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎-2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (I )，所述双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ; 所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。
2.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述发卡探针的双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Sss I甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn I内切酶。
3.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1~5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5’端或3’端的切刻内切酶为Nb.Bsm I切刻内切酶、Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、或Nt.BstNBI切刻内切酶。
4.如权利要求1所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测探针，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，包括: 发卡探针、引物-1、引物-2、发卡探针甲基化试剂、依赖甲基化的内切酶酶切试剂、环形探针连接试剂、滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂、DNA酶检测试剂， 其中，所述依赖甲基化的内切酶酶切试剂包括依赖甲基化的内切酶，所述环形探针连接试剂包括DNA连接酶和DNA外切酶，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂包括DNA聚合酶和切刻内切酶，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂； 所述发卡探针依次包括茎-1、环以及茎_2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (I )，所述双链DNA (I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ; 所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补。
6.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述发卡探针的双链DNA(I)具有甲基化酶的识别位点以及依赖甲基化的内切酶的酶切序列中，所述甲基化酶为Dam甲基化酶或M.Sss I甲基化酶，所述依赖甲基化的内切酶为Dpn I内切酶。
7.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述引物-1中，所述DNA酶序列为如SEQ ID NO:1~5所示的核苷酸序列；所述DNA酶序列的5，端或3，端的切刻内切酶为Nt.BspQI切刻内切酶、Nt.AlwI切刻内切酶、Nb.Bsm I切刻内切酶或Nt.BstNBI切刻内切酶。
8.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述引物-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求5所述的基于化学发光反应的甲基化酶检测试剂盒，其特征在于，所述DNA过氧化物酶检测试剂包括3-氨基邻苯二甲酰肼、硝酸双-N-甲基吖啶翁、2，4，5-三苯基咪唑、3，4，5-三羟基苯甲酸、双(2，4，6-三氯苯基)草酸盐或2，2'-氨基-二(3-乙基_苯并噻唑啉-6-磺酸)。
10.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提供发卡探针、引物-1、引物-2、发卡探针、引物-1、引物_2、发卡探针甲基化试剂、依赖甲基化的内切酶酶切试剂、环形探针连接试剂、滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂、DNA酶检测试剂， 其中，所述依赖甲基化的内切酶酶切试剂包括依赖甲基化的内切酶，所述环形探针连接试剂包括DNA连接酶和DNA外切酶，所述滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂包括DNA聚合酶和切刻内切酶，所述DNA酶检测试剂包括氯高铁血红素以及DNA过氧化物酶检测试剂； 所述发卡探针依次包括茎-1`、环以及茎_2，所述茎-1、环以及茎-2均为单链脱氧核苷酸，所述茎-1与茎-2互补形成双链DNA (I )，所述双链DNA (I)具有Dam甲基化酶的识别位点以及所述Dpn I内切酶的酶切位点，其中，所述甲基化酶的识别位点与环的末端碱基距离为2~8bp ; 所述引物-1为单链脱氧核苷酸，所述引物-1具有至少一个片段A，所述片段A的5’端或3’端具有切刻内切酶酶切位点的互补序列，所述片段A的核苷酸序列与DNA酶序列互补，其中，所述DNA酶序列为具有氯高铁血红素结合位点的多G核苷酸序列；所述引物-1还具有与所述发卡探针的部分核苷酸序列互补的序列，所述引物-2为单链脱氧核苷酸，所述引物-2与所述引物-1两端的核苷酸序列互补 '及 2)取待测甲基化酶样品，加入所述发卡探针和发卡探针甲基化试剂进行甲基化反应，得到含甲基化的发卡探针产物；及 3)将所得含甲基化的发卡探针产物加入依赖甲基化的内切酶酶切试剂进行酶切反应，得到单链DNA，所述单链DNA与引物-1的部分序列互补；及 4)将引物-1和引物-2混合，用环形探针连接试剂进行退火、连接、酶切处理，得到环形探针；及 5)取步骤3)所得的单链DNA和步骤4)所得的环形探针混合，加入滚换扩增及切刻内切酶酶切试剂，进行滚环扩增和酶切反应，得到切刻内切酶的酶切产物；及 6)取所得切刻内切酶的酶切产物加入DNA酶检测试剂，并检测化学发光信号。
11.一种基于化学发光反应的甲基化酶检测方法，用于检测待测样品中基化酶的浓度C，其特征在于，包括如下步骤: 将如权利要求10所述的基于DNA过氧化物酶的甲基化酶检测方法所得的化学发光信号代入下式Ic=147614.4+34572.31og10C 式中，Ic为所述化学发光信号的发光强度，所述浓度C为每毫升待测样品中含甲基化酶的单位数。
【文档编号】C12Q1/48GK103710453SQ201310746076
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】曾亚平, 张春阳 申请人:深圳先进技术研究院