一种双层循环系统的灌注式生物反应器的制造方法
【专利摘要】本实用新型涉及医疗器械中的生物反应器【技术领域】，更具体地，涉及一种双层循环系统的灌注式生物反应器。一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其中，包括培养罐、设于培养罐外部的外层循环系统、设于培养罐内部的内层循环系统和气体加注系统；解决细胞在培养过程中对培养液循环流动的矛盾需求问题，并能有效提高培养液中氧的溶解度及其分布的均匀度，有利于培养液中废气的排出，并能有效消除气泡进入细胞培养区域。
【专利说明】一种双层循环系统的灌注式生物反应器
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及医疗器械中的生物反应器【技术领域】，更具体地，涉及一种双层循环系统的灌注式生物反应器。
【背景技术】
[0002]现有生物反应器的结构如图1所示，其功能是在体外制造一个与体内相似的环境，以加速培养细胞、形成组织乃至器官的系统，可广泛应用于器官缺损患者替代、构建、保持或增强其组织功能，以及生物制药等领域。其原理为根据细胞在体内生长微环境的生理、物理、化学特性，利用工程技术，在体外构建一套装置，使其能提供与体内相近的微环境，以利于细胞在该体外微环境中进行增殖、分化，以及形成组织乃至器官。
[0003]图1为现有的灌注式生物反应器的结构示意图，图1中，培养液储存罐2中的培养液通过导管由蠕动泵6抽取到培养罐7中支架8的入口，透过支架8，流入到培养罐7中，培养罐7中的培养液通过导管由蠕动泵4从培养罐7中抽出，通过三通阀5，回流到培养液储存罐2或从导管3流入废弃液储存罐I中。含有氧气的气体从导气管9中加到培养液中，培养液中的废气也可通过导气管9排出。支架8多为多孔介质材料，种植在支架8内的细胞与流过支架的培养液之间存在营养物质与新陈代谢排泄物的交换过程。细胞可在反应器中进行大规模增殖，也可进而进行细胞分化。
[0004]细胞在体外培养过程中，需要相对稳定的微环境，同时又需要能进行高效物质交换的动态环境，这是一对矛盾的需求，现有灌注式生物反应器的培养液循环流动方式，无法有效兼顾这个矛盾需求；生物反应器中为细胞提供营养物质的培养液中需保持一定的溶氧度,为此需向培养液中加注含有氧气的混合气体,现有灌注式生物反应器在加注该混合气体时，存在一些问题。即现有灌注式生物反应器主要存在以下不足:
[0005](I)、现有灌注式生物反应器难以克服培养液在循环流动过程中存在的矛盾需求:从细胞所需的营养物质与其新陈代谢排泄物的有效传输角度，需要培养液不间断地连续循环灌注；然而，从细胞生长的微环境角度，需要维持相对稳定的微环境，如果细胞培养的微环境变换过快，会稀释细胞分泌的生长促进因子，不利于细胞增殖(参考文献:王甜甜，干细胞体外三维培养的研究进展，[J]国际检验医学杂志，2 O I 2年3月第3 3卷第6期)，为此，需要培养液维持相对稳定。现有灌注式生物反应器的常规解决办法是动态培养与静态培养相结合，即先静置培养一段时间，此过程中培养液不循环流动，细胞在宏观静止的微环境中培养，然后循环灌注培养一段时间，即启动培养液循环灌注功能，通过在培养罐与培养液储存罐间循环流动培养液，在动态培养细胞的同时，将反应罐内的培养液换为新鲜的培养液。交替进行这两种静态与动态培养过程。这种常规的解决方法，由于存在一段时间的静态培养，使得细胞培养的效率与质量不高。
[0006](2)、现有灌注式生物反应器在含氧混合气体的加注方式上存在问题。现有的灌注式生物反应器一般是在图1中的培养液储存罐2中通过导气管9将含有氧气的混合气体(包含氧气、二氧化碳、氮气)加入培养液储存罐2内的培养液中，这种加注气体的方式，使得培养液中的溶氧率较低，分布也不够均匀，并且容易导致产生的气泡随培养液进入培养罐7中，而气泡破裂时会对培养的细胞产生破坏作用。
【发明内容】
[0007]本实用新型为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷，提供一种双层循环系统的灌注式生物反应器，以解决细胞在培养过程中对培养液循环流动的矛盾需求问题,并能有效提高培养液中氧的溶解度及其分布的均匀度，有利于培养液中废气的排出，并能有效消除气泡进入细胞培养区域。
[0008]为解决上述技术问题，本实用新型采用的技术方案是:一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其中，包括培养罐、设于培养罐外部的外层循环系统、设于培养罐内部的内层循环系统和气体加注系统；
[0009]本方案中，通过外层循环系统实现培养罐内培养液从外部的培养液储存处获得更新；通过内层循环系统实现培养罐内培养液在培养罐内部进行循环流动。气体通过气体加注系统加入到搅拌室内的空气中，并排出未溶解入培养液的多余气体及细胞新陈代谢排泄的废气。
[0010]在生物反应器中设计了内、外双层循环灌注系统，外层循环灌注系统确保培养罐内培养液的营养物质浓度维持在有利于细胞进行物质交换的范围内；内层循环灌注系统实现了固定空间内的局部循环。在内层循环系统中，采用了桨叶搅拌的流体驱动与细胞培养区的分区域但共室的设计技术，使得细胞培养区的流体运动为平缓的层流，这种固定空间内的局部平缓层流，可确保细胞生长的微环境成分保持相对稳定，又能有利于细胞与培养液间物质交换的有效进行。
[0011]具体的，所述的外层循环系统包括废弃液储存罐、培养液储存罐、三通阀、第一蠕动泵、第二蠕动泵、培养液导入管和培养液导出管，培养液导入管一端连接培养罐内部，另一端连接第二蠕动泵，第二蠕动泵通过导管连接培养液储存罐；培养液导出管一端连接培养罐内部，另一端连接第一蠕动泵；三通阀包括三个出口，其第一出口连接第一蠕动泵，第二出口通过导管连接培养液储存罐，第三出口通过导管连接废弃液储存罐；外层循环系统启动后，第二蠕动泵产生的动力将培养液储存罐中的新鲜培养液从培养液导入管输送到培养罐内，同时，第一螺动泵将培养罐内的旧培养液从培养液导出管输送到三通阀处，通过控制三通阀，可以控制培养液导出管中的培养液回到培养液储存罐内，或是输送到废弃液储存罐内。所述外层循环系统用来实现培养液的间歇式循环，即按照设定的间隔时间，通过蠕动泵将培养罐中的培养液进行整体更换，此时内层循环可以同时进行，也可以停止。
[0012]所述的内层循环系统包括设于培养罐内的塔板、底部导通管、搅拌室，塔板的底部通过底部导通管与搅拌室的底部连接，内层循环系统还包括固定于培养罐上部的电机、与电机连接的连动杆、与连动杆固定的桨叶，连动杆和桨叶设于搅拌室内部；所述的搅拌室还开有出液口，出液口与培养罐内部连通；所述内层循环系统用来实现培养液在培养罐内进行局部连续循环，此时外层循环停止，培养罐中的培养液在搅拌室内桨叶搅拌的作用下，在塔板与搅拌室间进行局部小循环。
[0013]通过该内、外双层循环灌注系统,可以解决细胞培养对培养液循环流动的矛盾需求问题。所采用的外层循环可以更新培养罐中的培养液，更新后的培养液中营养物的浓度较高，细胞新陈代谢排泄物的浓度较低，此状况有利于细胞的新陈代谢过程有效进行；培养液更新完成后，停止外层循环，内层循环使得培养液仅在塔板与搅拌室之间进行局部循环，此局部空间的内部循环，使得细胞分泌的促生长因子仍停留在该局部空间之中，不会因该因子成分的过度过快稀释而对细胞的生长造成不利影响，同时，该局部循环，也有利于更新细胞周围的微环境，给细胞带来营养物质，带走新陈代谢排泄物，有利于细胞新陈代谢过程的顺利进行。当新陈代谢过程进行一定时间后，培养罐内的营养物浓度因被细胞吸收而浓度较低，而排泄后的废物浓度较高，不利于细胞新陈代谢所需要的物质交换过程的顺利进行时，则再次启动外层循环系统，将培养罐的培养液进行整体更换，如此反复交替进行，从而可解决细胞对培养液循环的矛盾需求问题，为细胞提供有利于其新陈代谢进程的微环境。
[0014]所述的气体加注系统包括气体导入管、气体导出管，气体导入管一端设于培养罐外部，另一端连接搅拌室的底部；气体导出管一端连接搅拌室的上部，另一端连接培养罐外部。
[0015]具体的，生物反应器还包括塔板固定接头、底座和底座固定杆，培养罐开口处设有顶盖，塔板固定接头一端固定于顶盖上，另一端固定塔板；底座固定杆一端固定于顶盖上，另一端固定底座，底座承托塔板。
[0016]具体的，所述的搅拌室包括搅拌室底座、设于搅拌室底座上的搅拌室外筒和搅拌室内筒；连动杆和桨叶设于搅拌室内筒内，气体导出管和出液口设于搅拌室外筒上部。
[0017]具体的，所述的搅拌室底座的圆周上开有气体导入口，气体导入口连接气体导入管，搅拌室内筒底部设有气体入口，气体入口与气体导入口连通。
[0018]所述的搅拌室内筒底部还设有培养液入口，培养液入口与底部导通管连通。
[0019]内层循环系统启动后，电机通过连动杆带动桨叶进行高速旋转，高速旋转的桨叶带动桨叶区域内的培养液向上向外快速甩出，使得桨叶下方区域因培养液的减少而压力下降，从而可将塔板区域的培养液通过底部导通管吸引到桨叶下方区域。随着桨叶的高速旋转而向上向外甩出的培养液，将沿着搅拌室内筒、搅拌室外筒的内壁面向上移动到达出液口，从出液口流出搅拌室，流回到塔板区域，形成一个培养罐内部的培养液循环流动的路线。
[0020]桨叶高速搅拌产生的培养液湍流经过搅拌室内筒的阻碍缓冲作用后，再从搅拌室外筒上方的出液口流出时，已经是平缓流动的层流，从而可避免快速复杂的湍流对塔板区域的影响，使得塔板区域的流体运动为简单的层流，这有利于塔板区域内的细胞生长微环境的相对稳定。
[0021]含有氧气的混合气体(含有氧气、二氧化碳、氮气)从气体导入管进入搅拌室内桨叶侧下方的培养液中，气体在培养液中产生的气泡，被高速旋转的桨叶瞬间击碎，并在桨叶的搅拌作用下，快速而均匀地溶解到培养液中。未溶解的多余气体则上浮到搅拌室上方，从气体导出管排出。细胞排泄到培养液中的废气随培养液进入到搅拌室内后，在桨叶的快速搅拌作用下，可快速从培养液中释放出，然后从气体导出管排出。
[0022]连动杆在电机的驱动下带动桨叶作高速旋转，对搅拌室内筒中的培养液产生上升力，拉动底部导通管内的培养液从培养液入口进入搅拌室内筒,实现了对培养罐内培养液进行局部循环的驱动功能；气体进入气体导入口，从气体入口到达桨叶的侧下方的培养液中，所产生的气泡会被快速旋转的桨叶击碎，从而实现了破除气泡的功能；进入到培养液的气体，在桨叶的搅拌作用下，能快速而均匀地溶解到培养液中，实现了氧在培养液中快速而均匀地溶解功能；培养液中的废气，在桨叶的搅拌作用下，能快速地从培养液中释放分离，实现了促进培养液中废气的释放分离功能。
[0023]在内层循环系统的搅拌室底部、桨叶的侧下方加入气体。加入的气体在培养液中产生的气泡，在高速转动的桨叶搅拌作用下，会被瞬间击碎。桨叶在高速转动时对不同比重的物质所产生的离心力不同，由于气体比重远小于培养液的比重，培养液会在较大离心力的作用下向外围分散，而少量未被及时击碎的气泡会在较小离心力的作用下，集中在旋涡中心区域而迅速与培养液分区域分布，然后向上浮出液面，从搅拌室的气体导出管排出，从而有效消除了气泡进入细胞培养区域后破裂时对细胞造成损害问题。气泡被击碎后，在高速搅拌的作用下，可以快速溶解入培养液中，提高氧气在培养液中的溶解度，而且可以均匀地分布到培养中。而培养液中的新陈代谢废气，在桨叶的快速搅拌作用下，可快速从培养液中释放到液面上，然后从气体导出管排出。通过该气体加注方式，可以有效提高培养液中氧的溶解度及其分布的均匀度，有利于培养液中废气的排出，并能有效消除气泡进入细胞培养区域。
[0024]与现有技术相比，有益效果是:
[0025]1、兼顾了细胞培养对生长的微环境的一对矛盾需求，即:为不过快过度稀释细胞所释放的促生长因子，细胞所在的微环境成分应维持相对稳定；为促进细胞与培养液间的物质交换，细部所在的微环境应有一定的变化，能及时补充细胞周期被细胞吸收的营养物质成分，带走细胞排泄的代谢物成分。
[0026]在生物反应器中设计了内、外双层循环灌注系统，外层循环灌注系统确保培养罐内培养液的营养物质浓度维持在有利于细胞进行物质交换的范围内；内层循环灌注系统实现了固定空间内的局部循环。在内层循环系统中，采用了桨叶搅拌的流体驱动与细胞培养区的分区域但共室的设计技术，使得细胞培养区的流体运动为平缓的层流，这种固定空间内的局部平缓层流，可确保细胞生长的微环境成分保持相对稳定，又能有利于细胞与培养液间物质交换的有效进行。
[0027]2、兼顾了含氧气体在培养液中快速、均匀加注，加注气体时产生气泡的消除，以及培养液中废气的有效排出问题。
[0028]在生物反应器内层循环灌注系统中桨叶旋转区域的培养液中加注气体的方法，通过快速旋转的桨叶，实现了含氧气体在培养液中快速、均匀加注，加注气体时产生气泡的消除，以及培养液中废气的有效排出功能。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1是现有的灌注式生物反应器整体示意图。
[0030]图2是本实用新型的整体示意图。
[0031]图3是本实用新型的局部放大示意图。
【具体实施方式】
[0032]附图仅用于示例性说明，不能理解为对本专利的限制；为了更好说明本实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
[0033]如图2、3所示，一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其中，包括培养罐5、设于培养罐5外部的外层循环系统、设于培养罐5内部的内层循环系统和气体加注系统；
[0034]外层循环系统包括废弃液储存罐1、培养液储存罐2、三通阀3、第一蠕动泵4A、第二螺动泵4B、培养液导入管6和培养液导出管7,培养液导入管6 —端连接培养罐5内部,另一端连接第二蠕动泵4B，第二蠕动泵4B通过导管连接培养液储存罐2 ;培养液导出管7 —端连接培养罐5内部，另一端连接第一蠕动泵4A ;三通阀3包括三个出口，其第一出口连接第一蠕动泵4A，第二出口通过导管连接培养液储存罐2，第三出口通过导管连接废弃液储存罐I ;外层循环系统启动后，第二蠕动泵4B产生的动力将培养液储存罐2中的新鲜培养液从培养液导入管6输送到培养罐5内，同时,第一螺动泵4A将培养罐5内的旧培养液从培养液导出管7输送到三通阀3处，通过控制三通阀3，可以控制培养液导出管中的培养液回到培养液储存罐2内，或是输送到废弃液储存罐I内。所述外层循环系统用来实现培养液的间歇式循环，即按照设定的间隔时间，通过蠕动泵将培养罐中的培养液进行整体更换，此时内层循环可以同时进行，也可以停止。
[0035]内层循环系统包括设于培养罐5内的塔板9、底部导通管12、搅拌室，塔板9的底部通过底部导通管12与搅拌室的底部连接，内层循环系统还包括固定于培养罐5上部的电机19、与电机19连接的连动杆20、与连动杆20固定的桨叶18，连动杆20和桨叶18设于搅拌室内部；所述的搅拌室还开有出液口 16，出液口 16与培养罐5内部连通；生物反应器还包括塔板固定接头8、底座10和底座固定杆11，培养罐5开口处设有顶盖，塔板固定接头8一端固定于顶盖上，另一端固定塔板9 ;底座固定杆11 一端固定于顶盖上，另一端固定底座10，底座10承托塔板9。搅拌室包括搅拌室底座24、设于搅拌室底座24上的搅拌室外筒15和搅拌室内筒17 ;连动杆20和桨叶18设于搅拌室内筒17内，气体导出管14和出液口 16设于搅拌室外筒15上部。气体加注系统包括气体导入管13、气体导出管14，气体导入管13一端设于培养罐5外部，另一端连接搅拌室的底部；气体导出管14一端连接搅拌室的上部，另一端连接培养罐5外部。
[0036]内层循环系统启动后，电机19通过连动杆20带动桨叶18进行高速旋转，高速旋转的桨叶18带动桨叶区域内的培养液向上向外快速甩出，使得桨叶下方区域因培养液的减少而压力下降，从而可将塔板9区域的培养液通过底部导通管12吸引到桨叶下方区域。随着桨叶18的高速旋转而向上向外甩出的培养液，将沿着搅拌室内筒、搅拌室外筒的内壁面向上移动到达出液口 16，从出液口 16流出搅拌室，流回到塔板9区域，形成一个培养罐内部的培养液循环流动的路线。
[0037]桨叶18高速搅拌产生的培养液湍流经过搅拌室内筒的阻碍缓冲作用后，再从搅拌室外筒上方的出液口 16流出时，已经是平缓流动的层流，从而可避免快速复杂的湍流对塔板9区域的影响，使得塔板9区域的流体运动为简单的层流，这有利于塔板9区域内的细胞生长微环境的相对稳定。
[0038]搅拌室底座24的圆周上开有气体导入口 21，气体导入口 21连接气体导入管13，搅拌室内筒17底部设有气体入口 22，气体入口 22与气体导入口 21连通。搅拌室内筒17底部还设有培养液入口 23，培养液入口 23与底部导通管12连通。[0039]含有氧气的混合气体(含有氧气、二氧化碳、氮气)从气体导入管13进入搅拌室内桨叶侧下方的培养液中，气体在培养液中产生的气泡，被高速旋转的桨叶18瞬间击碎，并在桨叶的搅拌作用下，快速而均匀地溶解到培养液中。未溶解的多余气体则上浮到搅拌室上方，从气体导出管14排出。细胞排泄到培养液中的废气随培养液进入到搅拌室内后，在桨叶18的快速搅拌作用下，可快速从培养液中释放出，然后从气体导出管14排出。
[0040]连动杆20在电机19的驱动下带动桨叶18作高速旋转，对搅拌室内筒中的培养液产生上升力，拉动底部导通管12内的培养液从培养液入口 23进入搅拌室内筒17，实现了对培养罐内培养液进行局部循环的驱动功能；气体进入气体导入口 21，从气体入口 21通过气体入口 22到达桨叶18的侧下方的培养液中，所产生的气泡会被快速旋转的桨叶18击碎，从而实现了破除气泡的功能；进入到培养液的气体，在桨叶18的搅拌作用下，能快速而均匀地溶解到培养液中，实现了氧在培养液中快速而均匀地溶解功能；培养液中的废气，在桨叶的搅拌作用下，能快速地从培养液中释放分离，实现了促进培养液中废气的释放分离功倉泛。
[0041]显然，本实用新型的上述实施例仅仅是为清楚地说明本实用新型所作的举例，而并非是对本实用新型的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本实用新型的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本实用新型权利要求的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其特征在于，包括培养罐(5)、设于培养罐(5)外部的外层循环系统、设于培养罐(5)内部的内层循环系统和气体加注系统； 所述的外层循环系统包括废弃液储存罐(I)、培养液储存罐(2)、三通阀(3)、第一蠕动泵(4A)、第二螺动泵(4B)、培养液导入管(6)和培养液导出管(7),培养液导入管(6)—端连接培养罐(5)内部，另一端连接第二蠕动泵(4B)，第二蠕动泵(4B)通过导管连接培养液储存罐(2);培养液导出管(7) —端连接培养罐(5)内部，另一端连接第一蠕动泵(4A);三通阀(3)包括三个出口，其第一出口连接第一蠕动泵(4A)，第二出口通过导管连接培养液储存罐(2)，第三出口通过导管连接废弃液储存罐(I)； 所述的内层循环系统包括设于培养罐(5)内的塔板(9)、底部导通管(12)、搅拌室，塔板(9)的底部通过底部导通管(12)与搅拌室的底部连接，内层循环系统还包括固定于培养罐(5)上部的电机(19)、与电机(19)连接的连动杆(20)、与连动杆(20)固定的桨叶(18)，连动杆(20)和桨叶(18)设于搅拌室内部；所述的搅拌室还开有出液口(16)，出液口(16)与培养罐(5)内部连通； 所述的气体加注系统包括气体导入管(13)、气体导出管(14)，气体导入管(13) 一端设于培养罐(5)外部，另一端连接搅拌室的底部；气体导出管(14) 一端连接搅拌室的上部，另一端连接培养罐(5)外部。
2.根据权利要求1所述的一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其特征在于，生物反应器还包括塔板固定接头(8)、底座(10)和底座固定杆(11)，培养罐(5)开口处设有顶盖，塔板固定接头(8)—端固定于顶盖上，另一端固定塔板(9);底座固定杆(11) 一端固定于顶盖上,另一端固定底座(10 )，底座(10 )承托塔板(9 )。
3.根据权利要求2所述的一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其特征在于，所述的搅拌室包括搅拌室底座(24)、设于搅拌室底座(24)上的搅拌室外筒(15)和搅拌室内筒(17);连动杆(20)和桨叶(18)设于搅拌室内筒(17)内，气体导出管(14)和出液口(16)设于搅拌室外筒(15)上部。
4.根据权利要求3所述的一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其特征在于，所述的搅拌室底座(24)的圆周上开有气体导入口(21)，气体导入口(21)连接气体导入管(13)，搅拌室内筒(17)底部设有气体入口(22)，气体入口(22)与气体导入口(21)连通。
5.根据权利要求4所述的一种双层循环系统的灌注式生物反应器，其特征在于，所述的搅拌室内筒(17 )底部还设有培养液入口( 23 )，培养液入口( 23 )与底部导通管(12 )连通。
【文档编号】C12M3/00GK203487159SQ201320289836
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】罗语溪, 高玉宝, 龚逸鸿, 蒋庆 申请人:中山大学