用于检测braf基因v600e突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有BRAF-F引物的试剂管、装有BRAF-R引物的试剂管、装有Probe-F探针的试剂管、装有Probe-R探针的试剂管、装有PCR?MIX试剂的试剂管被设置在所述小孔内。本实用新型结构简单、设计合理，检测步骤简便，检测速度快，便于在临床推广应用。
【专利说明】用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于分子生物学【技术领域】，涉及基因突变检测试剂盒，尤其涉及一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒。
【背景技术】
[0002]BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌(v-raf)致癌同源体BI，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。
[0003]BRAF基因的突变大致在2个区域:一个是exonll上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等位点的突变；另一个区域是在CR2区域中的抑制AKR磷酸化区域，突变后BRAF激酶处于持续活化状态，使细胞持续增殖，从而演化为癌细胞。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌以及肝癌等，均存在不同比例的BRAF基因突变，66%恶性黑色素瘤和15%结肠癌中BRAF基因存在体细胞错义突变。在人类肿瘤细胞中证实，BRAF基因有30多个突变位点，然而，大约80%?90%的BRAF基因突变发生在exonl5上的激活区，其中约92%位于第1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。
[0004]BRAF基因突变的患者接受EGFR-TKI靶向类药物治疗的有效率低，而且，V600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI (厄洛替尼或吉非替尼)及EGFR单抗药物(西妥昔单抗或帕尼单抗)治疗不敏感，因此，检测肿瘤患者BRAF基因V600E突变对于指导临床用药具有重要意义。
[0005]现有的检测BRAF基因V600E突变手段主要有限制性片段长度多态性(RFLP)和基因测序。限制性片段长度多态性技术是利用限制性内切酶识别DNA分子的特异序列，并于特定序列处切开DNA分子，产生不同大小、不同数量的限制性片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳行突变分析，其优点为结果稳定、重复性好，但是检测周期长、费用高、分析速度慢，且只能针对已知突变选取相应限制性内切酶，对未知突变作用有限。基因测序技术采用巢式PCR扩增BRAF基因外显子11和15，用双脱氧终止法，通过测序PCR反应后形成在3’末端带有荧光标记的相差I个碱基的不同长度的产物，根据每段DNA产物的电泳速度来检测整段DNA的序列，该检测方法的检测流程和结果分析均复杂、耗时。
实用新型内容
[0006]为了解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，可以快速、简便、准确地检测BRAF基因V600E突变。
[0007]为实现上述目的，本实用新型采取的技术方案是:一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有BRAF-F引物的试剂管(4)、装有BRAF-R引物的试剂管(5)、装有Probe-F探针的试剂管(6)、装有Probe-R探针的试剂管(7)、装有PCR MIX试剂的试剂管(8)被设置在所述小孔内。
[0008]其中，所述试剂盒还包括:装有去离子水的试剂管(9)。
[0009]其中，所述衬垫(3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
[0010]其中，所述探针Probe-F的5’端连接荧光报告基团FAM，3’端连接非荧光淬灭基团和MGB修饰基团；所述探针Probe-R的5’端连接荧光报告基团HEX，3’端连接非荧光淬灭基团和MGB修饰基团。
[0011]其中，所述引物浓度为5 μ mol/L，所述探针浓度为3 μ mol/L。
[0012]所述引物和探针的序列如下:
[0013]
【权利要求】
1.一种用于检测BRAF基因V600E突变的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括盒体(I)、盒盖(2)和设置在盒体(I)内的衬垫(3)，所述衬垫(3)上设有小孔，装有BRAF-F引物的试剂管(4)、装有BRAF-R引物的试剂管(5)、装有Probe-F探针的试剂管(6)、装有Probe-R探针的试剂管(7)，装有PCR MIX试剂的试剂管(8)被设置在所述小孔内。
2.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:装有去离子水的试剂管(9)。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:其中，所述衬垫(3)上设有6个小孔，所述小孔在所述衬垫(3)上分成两排平行排列。
【文档编号】C12M1/34GK203530311SQ201320689080
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】徐姣姣, 刘晓峰, 侯然, 王红霞, 杜崇岭, 梁超, 王绪华, 方国伟, 黄士昂, 陈忠 申请人:北京海思特临床检验所有限公司