物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用的制作方法

物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用，能够高精度地控制物质的移动速度，并且能够提高设备的耐久性。通过由在相交的方向上形成的第一电场及第二电场形成的移动路径，使具有电荷的物质移动。
【专利说明】物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用，特别是涉及具有电荷的物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用。
【背景技术】
[0002]目前，在各种各样的领域中，要求开发出能够将物质(例如，蛋白质、核酸等)的移动速度高精度地控制为所希望的速度的技术。
[0003]例如，在用于解码DNA的碱基序列的测序仪中，使DNA移动的同时，读取该DNA的碱基序列。此时，若泳动速度过快，则不能高精度地确定DNA的碱基序列，另一方面，若泳动速度过慢，则为了读取DNA的碱基序列，需要非常长的时间。因此，在测序仪的领域中，要求开发出能够将物质的移动速度高精度地控制为所希望的速度的技术。
[0004]特别而言，近年来对于适合各个性的定制医疗备受注目。为了实现该定制医疗，需要在短时间内闻精度地读取个人基因组的喊基序列，正确掌握个人基因组的喊基序列中的特征点。因此，将物质的移动速度高精度地控制为所希望的速度的技术的开发可以说是当务之急。
[0005]鉴于上述情况，以往使用如下技术:在使膜蛋白负载于磷脂双层膜的设备中，以在一对电极间通过的方式对核酸进行电泳，由此解码该核酸的碱基序列(例如，参照非专利文献I)。具体而言，在非专利文献I记载的技术中，以在由α-溶血素(a-haemolysin)形成的孔中通过的方式对核酸进行电泳，在调节核酸的移动速度的同时，测量此时的离子电流，由此确定正在孔中通过的核酸的碱基序列。
[0006]现有技术文献
[0007]专利文献
[0008]非专利文献I:Clarke, J., Wu, H.-C., Jayasinghe, L., Patel, A., Reid, S.&Bayley,H.Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing.Nat.Nanotechnol.4，265-270(2009)

【发明内容】

[0009]发明所要解决的问题
[0010]但是，上述那样的现有技术具有难以高精度地控制I分子的移动速度的问题。特别是，上述那样的现有技术具有难以减慢分子的移动速度的问题。
[0011]另外，上述那样的现有技术具有由于使用蛋白质作为设备的材料，因而设备的耐久性低的问题。
[0012]本发明是鉴于上述以往的问题而完成的，其目的在于，提供一种物质的移动速度的控制方法及控制装置、以及它们的应用，能够高精度地控制物质的移动速度，并且能够提高设备的耐久性。
[0013]用于解决问题的方法[0014]为了解决上述课题，本发明的控制方法为物质的移动速度的控制方法，具有使具有电荷的物质沿着由第一电极对形成的第一电场移动的移动步骤，其特征在于，在上述物质的移动路径的至少一部分，通过第二电极对在与上述第一电场相交的方向上形成有第二电场。
[0015]为了解决上述课题，本发明的控制装置的特征在于，具有设置于第一电极对之间的流路、和在上述流路的至少一部分设置的第二电极对，并且，由上述第一电极对形成的第一电场的方向与由上述第二电极对形成的第二电场的方向相交。
[0016]为了解决上述课题，本发明的确定多核苷酸的核苷酸序列的装置的特征在于，具有本发明的控制装置。
[0017]发明效果
[0018]本发明获得能够高精度地控制物质的移动速度的效果。特别是，本发明获得使物质的移动速度减速的效果。
[0019]本发明能够高精度地控制物质的移动速度，因此获得能够高精度地进行与该物质有关的各种各样的测定的效果。例如，以DNA的碱基序列的读取为例，根据本发明能够使DNA的移动速度减速，因此能够防止逐个检测的构成DNA的碱基的信号(例如，电流的信号、荧光的信号等)重叠。其结果是，获得能够正确地确定DNA的碱基序列的效果。
【专利附图】

【附图说明】
[0020]图1是表示本发明的移动速度的控制方法中的控制理论的图。
[0021]图2是表示本发明的实施例的控制装置中的扫描电子显微镜的图像的图。
[0022]图3是表示在本发明的实施例的第二电极对的正极与负极之间形成的间隙的形态的图。
[0023]图4是表示对本发明的实施例的控制装置施加的电压和在控制装置中流动的电流的状态的图。
[0024]图5是表示本发明的实施例的控制装置的密封状态的图。
[0025]图6(a)和(b)是表示在本发明的实施例的控制装置中，在将Ag/AgCl电极间的电压设为Vlmg=0.5V、将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间的电压设为Vtrans=OV的情况下，离子电流与时间的关系的图。
[0026]图7(a)和(b)是表示在本发明的实施例的控制装置中，在将Ag/AgCl电极间的电压设为Vlmg=0.5V、将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间的电压设为Vtrans=0.5V的情况下,离子电流与时间的关系的图。
[0027]图8是表示本发明的实施例的控制装置中的物质的移动时间的分布的图。
[0028]图9是表示本发明的实施例的控制装置的制造步骤的图。
【具体实施方式】
[0029]以下，详细说明本发明的实施方式，但本发明不限于此。需要说明的是，在本说明书中记载为“A?B”的情况是指“A以上且B以下”。
[0030]〔1.移动速度的控制方法〕
[0031]首先，使用图1说明本发明的移动速度的控制方法的控制理论。需要说明的是，在图1中以具有负电荷的物质(具体而言DNA)为例子说明控制理论，但作为本领技术人员，若阅读本说明书，则能够容易理解只要是本发明，即使是具有正电荷的物质也能够控制移动速度。
[0032]如图1所示，在本发明的移动速度的控制方法中，通过第一电极对(在图1的纸面的上下设置的电极对)，使具有电荷的物质移动。即，具有负电荷的物质从第一电极对的负极侧(图1的纸面上侧)朝向第一电极对的正极侧(图1的纸面下侧)移动。该移动方向成为应使物质移动的方向，在本发明中，控制向该方向的移动速度。
[0033]如图1所示，在物质的移动路径上，除第一电极对之外形成有第二电极对(在图1的纸面左右设置的电极对)。
[0034]在第二电极对的正极与具有负电荷的物质之间产生静电相互作用。并且，通过该静电相互作用，能够使从第一电极对的负极侧朝向第一电极对的正极侧移动的物质的移动速度减速。
[0035]在上述物质为具有正电荷的物质的情况下，该物质从第一电极对的正极侧(图1的纸面下侧)朝向第一电极对的负极侧(图1的纸面上侧)移动。
[0036]在这种情况下，在第二电极对的负极与具有正电荷的物质之间产生静电相互作用。并且，通过该静电相互作用，能够使从第一电极对的正极侧朝向第一电极对的负极侧移动的物质的移动速度减少。
[0037]在物质的移动路径中存在离子的情况下，除了上述静电相互作用带来的减速效果以外，还能够期待电渗流带来的减速效果。以下说明该电渗流带来的减速效果。
[0038]如图1所示，在物质的移动路径中存在阴离子(例如CD及阳离子(例如K+)的情况下，第二电极对的正极的表面发生阴离子所产生的电渗流，并且在第二电极对的负极的表面发生阳离子所产生的电渗流。需要说明的是，阴离子所产生的电渗流从第一电极对的负极侧流向正极侧，阳离子所产生的电渗流从第一电极对的正极侧流向负极侧。
[0039]在使具有负电荷的物质移动的情况下，在第二电极对的负极的表面发生的电渗流向与物质的移动方向相反的方向流动。因此，除上述静电相互作用之外，还能通过该电渗流使具有负电荷的物质的移动速度减速。
[0040]另一方面，在使具有正电荷的物质移动的情况下，在第二电极对的正极的表面发生的电渗流向与物质的移动方向相反的方向流动。因此，除上述静电相互作用之外，还能通过该电渗流使具有正电荷的物质的移动速度减速。
[0041]以上说明了本发明的移动速度的控制方法的控制理论，因此，以下对基于该控制理论的移动速度的控制方法的实施方式进行说明。
[0042]本实施方式的移动速度的控制方法，具有使具有电荷的物质沿着由第一电极对形成的第一电场移动的移动步骤。即，在本实施方式的移动速度的控制方法中，通过第一电极对和具有电荷的物质的静电相互作用，使该物质朝向所希望的方向移动，且沿着由第一电极对形成的第一电场(从第一电极对的正极朝向负极的电场)，形成物质的移动路径。
[0043]上述物质只要具有电荷即可，其具体的构成没有特别的限定。例如，可以是原子、分子、聚合物、或者它们的复合体。由于上述物质具有电荷，因此通过第一电极对能够使该物质向目的方向移动，并且通过第二电极对能够控制该物质的移动速度。
[0044]上述物质所具有的电荷可以是负电荷，也可以是正电荷。在上述物质所具有的电荷为负电荷的情况下，上述物质从第一电极对的负极侧朝向正极侧移动，在上述物质所具有的电荷为正的情况下，上述物质从第一电极对的正极侧朝向负极侧移动。
[0045]在上述物质为物质A和物质B的复合体的情况下，只要物质A和物质B中的至少一者具有电荷即可。当然，也可以是物质A和物质B这两者均具有电荷。
[0046]在物质A和物质B这两者均具有电荷的情况下，物质A所具有的电荷和物质B所具有的电荷可以均为正电荷或者均为负电荷，也可以是一方为正电荷而另一方为负电荷。即使在上述复合体中电荷部分地抵消，只要在将上述复合体视为整体的情况下该复合体具有电荷即可。换言之，上述复合体只要具有通过第一电极对能够移动的、且通过第二电极能够控制移动速度的程度的电荷即可。
[0047]在上述物质为物质A和物质B的复合体的情况下，物质A和物质B只要以在移动中不会相互脱离的程度的力相互键合即可。例如，物质A和物质B经由共价键、离子键、氢键、疏水键、或者从它们中选择的多个键相互键合即可。
[0048]作为上述物质A或者物质B，例如可以使用离子型表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠盐)、带电的有机粒子或者带电的无机粒子。由于这些物质自身具有电荷，因此在与其他物质形成复合体的情况下，可以对该复合体赋予电荷。即，若使用这些物质，则能够容易地形成具有电荷的复合体。
[0049]上述离子型表面活性剂，能够容易地使所希望的物质包含于其自身所形成的胶束中。因此，若使用离子型表面活性剂作为形成复合体的成分之一，则能够容易形成具有电荷的复合体。
[0050]由上述说明可知，只要是本申请发明，即使是原本不具有电荷的物质，通过与具有电荷的其他物质形成复合体，也能够控制移动速度。
[0051]作为上述具有电荷的物质的具体例，可以列举:核酸(DNA或者RNA)、氨基酸、蛋白质、花粉、病毒、细胞、有机粒子或者无机粒子，但本发明不限于此。
[0052]作为上述第一电极对的具体的构成没有特别的限定，可以适当使用公知的电极对。需要说明的是，在本实施方式的移动速度的控制方法中，在该第一电极对的正极与负极之间形成物质移动的移动路径。
[0053]作为上述第一电极对的具体的构成没有特别的限定，可以适当使用公知的电极。例如，可以使用Ag/AgCl电极等，但本发明不限于此。
[0054]上述第一电极对中的正极与负极之间的距离没有特别的限定，可以适当设定。例如，可以考虑物质的电荷、对第一电极对施加的电压、第二电极对的长度等而适当设定。
[0055]在本实施方式的移动速度的控制方法中，在上述物质的移动路径的至少一部分，通过第二电极对，在与上述第一电场相交的方向上形成第二电场。即，在本实施方式的移动速度的控制方法中，通过第一电极对，形成从第一电极对的正极朝向负极的方向的第一电场，且通过第二电极对，形成从第二电极对的正极朝向负极的方向的第二电场。并且，以第一电场的方向与第二电场的方向相交的方式形成第一电场及第二电场。
[0056]若是上述构成，则在上述物质通过由第一电极对形成的第一电场移动时，其移动过程的至少一部分中，在由第二电极对形成的第二电场之中通过。并且，在通过该第二电场之中时，物质的移动速度被减速。
[0057]第一电场的方向与第二电场的方向相交的角度没有特别的限定，可以设定为所希望的角度。例如，可以构成为第一电场的方向和上述第二电场的方向相互正交。若是该构成，则通过第二电极对，能够使静电相互作用有效地作用于物质，使物质有效地减速。此外，若是该构成，则通过第二电极对，能够有效地发生电渗流，通过该电渗流有效地使物质减速。
[0058]在上述第二电极对的正极与负极之间形成间隙，通过该间隙能够形成移动路径的一部分。并且，在物质通过该间隙时，能够使静电相互作用作用于物质。这样形成的间隙的尺寸没有特别的限定，可以适当设定为所希望的尺寸。
[0059]例如，在图3中示出由相对的第二电极对的正极与负极形成的间隙的一例。在图3中，该间隙以具有宽度(W)、高度(H)和长度(L)的长方体的形状表示。上述宽度(W)相当于第二电极对的正极与负极之间的距离。并且，物质沿着上述长度(L)移动。即，物质从图3的纸面的里侧朝向纸面的近前移动、或者从图3的纸面的近前朝向纸面的里侧移动。需要说明的是，虽然图3没有图示，但上述间隙的上侧可以根据需要密封。
[0060]上述宽度(W)、高度⑶及长度(L)各自的尺寸没有特别的限定，可以适当设定为所希望的尺寸。
[0061]上述宽度(W)的尺寸没有特别的限定，可以根据物质的种类、物质的移动路径中配置的液体或凝胶等而适当设定。例如，可以是Inm?IOOOnm,也可以是Inm?IOOnm,也可以是Inm?60nm,也可以是50nm?60nm。当然，上述宽度(W)可以是Inm以下的尺寸，也可以是IOOOnm以上的尺寸。
[0062]例如，核苷酸的分子直径是本领技术人员公知的，因此可以基于该分子直径设定上述宽度(W)的尺寸。例如，单磷酸形式的核苷酸的分子直径为约lnm，因此可以将上述宽度(W)设为例如0.5nm?2nm、lnm?1.5nm、或者Inm?1.2nm。
[0063]从使物质的速度有效地减速的观点出发，可以说优选宽度(W)较窄。
[0064]另外，上述宽度(W)的尺寸可以是，在第二电极对的正极及负极的表面产生的双电层(参照图1)和上述物质不重叠的程度的尺寸。即，将第二电极对的正极及负极的表面所产生的双电层的厚度(连接第二电极对的正极与负极的方向的长度)分别设为“X”及“Y”，将在第二电极对的正极与负极之间移动时的物质的宽度(连接第二电极对的正极与负极的方向的长度)设为“Z”的情况下，可以是W>X+Y+Z。
[0065]需要说明的是，已知双电层的厚度依赖于形成该双电层的离子的浓度。因此，上述“X”及“Y”可以根据存在于移动路径中的离子的浓度等而适当设定。
[0066]另外，在上述物质的形状可近似为直链的情况下，可以将该直链的短边方向的长度设为上述“Z”。当然，也可以将该直链的长边方向的长度设为上述“Z”，还可以将直链的短边方向的长度和短边方向的长度的平均值设为上述“ Z ”。从更可靠地使第二电极对的正极及负极的表面所产生的双电层和上述物质不重叠的观点出发，可以说优选将直链的长边方向的长度设为上述“Z”。另外，在上述物质的形状可近似为球的情况下，可以将该球的直径的长度设为上述“Z”。但是，上述“Z”的规定只不过是一例，本发明不限于此。
[0067]若是满足上述W>X+Y+Z的构成，则在使多个物质移动时，可以将这些物质的移动速度更正确地接近正态分布。即，若是该构成，则能够更高精度地控制物质的移动速度。
[0068]上述高度(H)的尺寸没有特别的限定，可以根据物质的种类、物质的移动路径中配置的液体或凝胶等而适当设定。例如，可以是Inm?IOOOnm,也可以是Inm?IOOnm,也可以是Inm?60nm,可以是50nm?60nm。当然，上述高度(H)也可以是Inm以下的尺寸，也可以是IOOOnm以上的尺寸。
[0069]与上述宽度(W)同样地，上述高度⑶的尺寸也可以设定为0.5nm?2nm、lnm?
1.5nm、或者 Inm ?1.2nm。
[0070]上述长度(L)的尺寸没有特别的限定，可以根据物质的种类、物质的移动路径中配置的液体或凝胶等而适当设定。例如，可以是Inm?IOOOnm,也可以是IOOnm?500nm,也可以是IOOnm?200nm。当然，上述长度(L)也可以是Inm以下的尺寸，也可以是IOOOnm以上的尺寸。
[0071]从使物质的速度有效地减速的观点出发，可以说优选长度(L)长。
[0072]对上述第二电极对施加的电压没有特别的限定，能够适当施加所希望的电压。例如，也可以是0.1OV?1.00V,也可以是0.25V?0.75V,也可以是0.50V。
[0073]作为上述第二电极对的具体的构成没有特别的限定，可以适当使用公知的电极。例如，可以使用Pt/Au/Pt/Si02电极等，但本发明不限于此。
[0074]在上述物质进行移动的移动路径的至少一部分中，可以配置液体及凝胶中的至少一者。当然，也可以配置液体及凝胶这两者。需要说明的是，在将液体及凝胶中的至少一者配置于移动路径的情况下，优选至少配置在由第二电极对的正极与负极形成的间隙中。
[0075]作为上述液体没有特别的限定，可列举例如水。作为上述凝胶没有特别的限定，可列举例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
[0076]优选在上述液体及凝胶中，至少含有具有与上述物质所含有的电荷相反的电荷的离子。通过上述构成，能够使电流在第一电极对之间和第二电极对之间流动。并且，由此能够高灵敏度地检测在第一电极对之间流动的电流的变化。另外，通过上述构成，能够使电渗流在第二电极对的正极及负极的表面发生。并且，由此能够使物质的移动速度减速。
[0077]作为上述离子的具体的构成没有特别的限定。例如，只要在配置于移动路径的液体或者凝胶中溶解KCl、NaCl或者CaCl2等即可。从发生更大的电渗流的观点出发，可以说在上述物质中优选离子的价数小的物质，具体而言优选KCl或者NaCl等。
[0078]溶解于上述液体或者凝胶中的离子的浓度没有特别的限定，例如，可以是
0.0lM?1M，也可以是0.1M?0.5M,也可以是0.1M?0.25M。
[0079]本实施方式的移动速度的控制方法也可以具有检测步骤，该检测步骤对使多个物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。需要说明的是，使移动的物质的数量没有特别的限定，只要是可对移动速度的分布进行统计性研究的程度的数量即可。
[0080]如后述的实施例所示，通过静电相互作用及电渗流能够将物质的移动速度减速，在通过这些作用有效地减速的情况下，物质群的移动速度表现为多个正态分布。即，在上述检测步骤中，若能检测出物质群的移动速度分成多个正态分布，则可判定为能够将物质的移动速度有效地减速。
[0081]上述检测步骤只要是能够对物质群的移动速度分成多个正态分布进行检测的步骤即可，其具体的构成没有特别的限定。例如，上述检测步骤可以为如下步骤:检测在第一电极对之间流动的电流值降低的瞬间，并且测定该降低瞬间的时间(电流值降低期间的时间)，由该时间计算物质的移动速度，并统计性地计算该移动速度的分布。
[0082]上述检测步骤可以进一步包括选择属于所希望的正态分布的物质的选择步骤。通过上述选择步骤，可以选择更合适的移动速度的物质群。需要说明的是，该选择步骤所选择的正态分布没有特别的限定，可以是移动速度快的正态分布，也可以是移动速度慢的正态分布。
[0083]例如，考虑基于本实施方式的移动速度的控制方法读取DNA的碱基序列的情况。在移动速度存在两种的情况下，若读取以慢的移动速度移动的DNA的碱基序列，则能够使DNA的碱基序列的确定的精度飞跃性地上升。另一方面，若读取以快的移动速度移动的DNA的碱基序列，则与通常(例如，没有第二电极对的构成)相比，不仅DNA的碱基序列的确定的精度能够上升，而且与读取以慢的移动速度移动的DNA的碱基序列的情况相比，能够缩短读取所需的时间。即，通过具有上述检测步骤及选择步骤，能够以所需的精度，在尽量短的时间内读取DNA的碱基序列。
[0084]用于实现上述检测步骤及上述选择步骤的构成没有特别的限定，能够使用公知的电流测定装置(例如,Molecular Devices公司制造的Axopatch200B系统等)及统计处理软件(例如，OriginLab公司制造的Origin)来实现。
[0085]〔2.移动速度的控制装置〕
[0086]以下，对本实施方式的移动速度的控制装置进行说明。需要说明的是，以下省略与上述〔1.移动速度的控制方法〕重复的说明。
[0087]本实施方式的移动速度的控制装置具有设置于第一电极对之间的流路、和在上述流路的至少一部分设置的第二电极对。并且，由上述第一电极对形成的第一电场的方向、和由上述第二电极对形成的第二电场的方向相交。此时，可以说优选上述第一电场的方向和上述第二电场的方向相互正交。
[0088]作为上述第一电极对没有特别的限定，可以适当使用公知的电极对。例如，可以使用Ag/AgCl电极等作为上述第一电极对，但本发明不限于此。
[0089]上述第一电极对中的正极与负极之间的距离没有特别的限定，可以适当设定。例如，可以考虑物质的电荷、对第一电极对施加的电压等而适当设定。
[0090]作为上述第二电极对没有特别的限定，可以适当使用公知的电极对。例如，可以使用Pt/Au/Pt/Si02电极等作为上述第二电极对，但本发明不限于此。
[0091 ] 上述流路大致可分为没有被第二电极对夹持的部分、和被第二电极对夹持的部分。被第二电极对夹持的部分可以设置于流路的任意部位。例如，可以设置于流路的前端，也可以设置于流路的中途，也可以设置于流路的末端。
[0092]设置于上述流路的第二电极对的数量没有特别的限定，可以是一个，也可以是多个。若在一个流路上设置多个第二电极对，则可以对物质的移动速度进行精细的控制。例如，在通过一个流路进行与物质有关的多种测定(例如，测定A及测定B)的情况下，可通过配置于流路的上游侧的第二电极对将物质的速度调节为适于测定A的速度后，进行测定A，然后，通过配置于流路的下游侧的第二电极对将物质的速度重新调节为适于测定B的速度后，进行测定B。通过上述构成，可使用一个流路，将多个测定在针对各测定最适的条件下进行。需要说明的是，上述测定A及测定B的具体的构成没有特别的限定，可列举例如在第二电极对之间流动的离子电流的测定、物质所发出的荧光的测定等。
[0093]上述流路的未被第二电极对夹持的部分的形状没有特别的限定，可以适当设为所希望的形状。例如，可以是如下那样的形状:可将在流路的未被第二电极对夹持的部分中移动的物质导入流路的被第二电极对夹持的部分，并且可接收在流路的被第二电极对夹持的部分中移动的物质。
[0094]例如，可以将上述流路的未被第二电极对夹持的部分的截面(与物质的移动方向垂直的截面)的宽度设为500nm?lOOOnm，高度设为500nm?lOOOnm，但并不限于此。该宽度可设定为比在第二电极对的正极与负极之间的间隙的宽度更宽，该高度可设定为比第二电极对的正极与负极之间的间隙的高度更高。
[0095]上述流路的被第二电极对夹持的部分的形状可适当设定，没有特别的限定。该流路的被第二电极对夹持的部分的形状与上述〔1.移动速度的控制方法〕中的“由相对的第二电极对的正极与负极形成的间隙”对应，已使用图3详细地进行了说明。因此，在此，省略其说明。
[0096]也可以在上述流路中配置液体或者凝胶中的至少一者，该液体或者凝胶至少含有具有与上述物质所具有的电荷相反的电荷的离子。已对上述离子、液体及凝胶等进行了说明，因此在此省略其说明。
[0097]本实施方式的移动速度的控制装置也可以具有检测部(检测单元)，该检测部对使多个上述物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。需要说明的是，使移动的物质的数量没有特别的限定，只要是可对移动速度的分布进行统计性研究的程度的
数量即可。
[0098]若能通过上述检测部检测出物质群的移动速度分成多个正态分布，则能够判断能够将物质的移动速度有效地减速。
[0099]上述检测部只要是能够对物质群的移动速度分成多个正态分布进行检测的构成即可，其具体的构成没有特别的限定。例如，上述检测部可以是如下构成:检测在第一电极对之间流动的电流值降低的瞬间，并且测定该降低瞬间的时间(电流值降低期间的时间)，由该时间计算物质的移动速度，并统计性地计算该移动速度的分布。
[0100]上述检测部也可以进一步包括选择属于所希望的正态分布的物质的选择部(选择单元)。通过上述选择部，能够选择更适合的移动速度的物质群。需要说明的是，该选择部所选择的正态分布没有特别的限定，可以是移动速度快的正态分布，也可以是移动速度慢的正态分布。
[0101]上述检测部及选择部的具体构成没有特别的限定，可以使用公知的电流测定装置(例如，Molecular Devices公司制造的Axopatch200B棒等)、统计处理软件(例如，OriginLab 公司制造的 Origin)。
[0102]〔3.确定多核苷酸的核苷酸序列的装置〕
[0103]本实施方式的确定多核苷酸的核苷酸序列的装置具有本发明的控制装置。已对本发明的控制装置进行了说明，因此在此对其他构成进行说明。
[0104]本实施方式的确定多核苷酸的核苷酸序列的装置可通过将公知的所谓测序仪和本发明的控制装置组合而构成。需要说明的是，上述多核苷酸的构成成分可以是DNA，也可以是RNA。
[0105]例如，在公知的测序仪中存在有如下类型的测序仪:在通过凝胶(例如，板状的凝胶、毛细管状的凝胶)对附加有荧光染料的DNA片段群进行分离的同时，对各DNA片段附加的荧光染料的种类进行检测，由此读取碱基序列。[0106]在这种情况下，作为由凝胶形成的DNA片段的移动路径的至少一部分配置本发明的控制装置，并且在该控制装置的下游侧配置用于检查荧光的构成即可。通过上述构成，附加有荧光染料的DNA片段通过第二电极对之间时使该DNA片段的移动速度减速，然后，检测荧光。其结果是，能够高精度地确定碱基序列。
[0107]或者，通过将PCT/JP2011/054631中所公开的“确定多核苷酸的核苷酸序列的装置”和本发明的控制装置组合，可构成本发明的确定多核苷酸的核苷酸序列的装置。
[0108]在这种情况下，也与上述情况同样地，在DNA片段的移动路径中，在第二电极对的下游侧配置用于读取碱基序列的构成即可。
[0109]需要说明的是，作为参考在本说明书中引用PCT/JP2011/054631。
[0110]实施例
[0111]〈1.控制装置的制作〉
[0112]通过以下的步骤I?9制作了本实施例的控制装置。以下，参照图9的同时，说明本实施例的控制装置制造方法。需要说明的是，图9是各步骤中的控制装置的俯视图。另夕卜，下述步骤I?2为在基板上制作Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的步骤，步骤3?步骤9为在基板上制作流路的步骤。
[0113]〈步骤1>
[0114]在被厚度300nm的SiO2热氧化被膜覆盖的掺杂硅晶圆上，通过光刻法图案形成引出电极(抗蚀剂:AZ5206E)。
[0115]然后，通过基于高频磁控派射法的金属蒸镀，层叠Pt(2nm)/Au(20nm)/Pt(2nm)膜。
[0116]在将上述基板浸入N，N- 二甲基甲酰胺8小时后，通过超声波清洗将基板上的抗蚀剂剥离，由此制作Pt/Au/Pt引出电极。
[0117]< 步骤 2>
[0118]将在Pt/Au/Pt引出电极的附近标注的外部标记作为指标，通过电子束光刻法光刻出纳米间隙电极(抗蚀剂:ZEP520A-7 ;电极间距离50nm)。
[0119]然后，通过高频磁控派射法，蒸镀Pt(2nm)/Au(30nm)/Pt(2nm)/Si02(50nm)层叠膜。
[0120]在将上述基板浸入N，N-二甲基甲酰胺8小时后，经由基于超声波清洗的剥离工艺，从而制作Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极。
[0121]〈步骤3>
[0122]通过高频磁控溅射法，在基板的整个面上蒸镀SiO2 (15nm) /Cr (IOOnm)膜。
[0123]〈步骤4>
[0124]将在步骤2中使用的外部标记设为指标，通过电子束光刻法(抗蚀剂:ZEP520A-7)，在Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极附近光刻出四边形的图案阵列。
[0125]然后，通过将基板浸入Cr蚀刻溶液(室温下60秒钟)，抗蚀剂被除去且将露出的Cr层除去。
[0126]〈步骤5>
[0127]将残留的Cr层用作掩模，通过反应性离子蚀刻法，将露出的SiO2层在深度方向上挖掘500nm。由此，制作高度500nm的柱并排的微流路。[0128]在进行离子蚀刻后，使用Cr蚀刻溶液，将残留的Cr层除去。
[0129]〈步骤6>
[0130]通过高频磁控溅射法，在基板上蒸镀25nm的厚度的Cr膜。
[0131]〈步骤7>
[0132]通过基于电子束光刻法的重叠光刻(抗蚀剂:ZEP520A-7)，在电极上光刻出宽度500nm的流路。
[0133]通过将上述基板的样品浸入Cr蚀刻溶液，将成为流路部分的Cr除去。
[0134]〈步骤8>
[0135]采用反应性离子蚀刻法(CF4、4.2Pa、100W)，将露出的SiO2挖掘50nm的深度，由此制作埋入了 Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的流路。
[0136]〈步骤9>
[0137]最后，使用Cr蚀刻溶液将残留的Cr层除去。此时，设计为在Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的上部残留有厚度15nm的SiO2层的方式。由此，通过用于在后段密封流路的PDMS (Polydimethylsi1xane,聚二甲娃氧烧)块，也能够将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的上部密封(PDMS难以吸附于金属)。
[0138]〈预处理〉
[0139]通过上述步骤I?9制作的控制装置在实际使用前进行预处理。以下说明该预处理的具体的内容。
[0140]在实际使用控制装置的情况下，也可以使用PDMS块密封所制作的控制装置的上部。通过上述构成，能够防止液体从流路泄漏。
[0141]在PDMS块中，在粘接于基板一侧的表面制作微流路。其制作方法如下。
[0142]首先，制作用于制作PDMS块的微流路的铸模。具体而言，在硅晶圆上涂布光致抗蚀剂SU-83050 (膜厚200 μ m)，以90°C加热45分钟。在SU-83050的溶剂蒸发后，花I小时将基板缓慢地冷却至室温。
[0143]通过光刻法，在上述基板上光刻出宽度0.4mm的流路图案。接着，通过浸入SU-83050的显影液，将曝光的部分的SU-83050除去，从而制作铸模。
[0144]然后，在置于培养皿中的铸模上流入PDMS (Sylgard(注册商标)184)，以70°C加热I小时，从而使PDMS固化。
[0145]按20mm的大小切取固化的PDMS，从而得到具有流路的PDMS块。
[0146]在使用PDMS块密封流路时，对吸附侧的PDMS的表面、和流路设备的表面进行氧等离子体处理(50W、45秒)。
[0147]然后，通过迅速将上述表面彼此对合，使PDMS块与SiO2吸附，使流路密封。此时，预先在PDMS块中制作6个贯通孔。其中两个贯通孔用于插入用于测量在流路中流动的离子电流(后述的IitJ的Ag/AgCl电极，其他4个贯通孔用作含有分子的溶液的导入口。
[0148]〈2.第二电极对之间的间隙的形状及尺寸的确认〉
[0149]为了确认通过上述〈1.控制装置的制作 > 制作的控制装置的形状，使用扫描电子显微镜观察所制作的控制装置。在图2中示意地表示使用扫描电子显微镜观察的控制装置的图像，在图3中示意地表示由相对的Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极(与第二电极对对应)形成的间隙的构造。[0150]如图3所示，由相对的Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极形成的间隙的长度(L)为约200nm,高度⑶为约50nm,宽度(W)为约60nm。
[0151]〈3.密封状态的确认〉
[0152]确认通过上述〈1.控制装置的制作 > 制作的控制装置是否被PDMS块密闭。以下参照图4和5的同时说明确认的方法及结果。
[0153]向通过上述〈1.制造装置的制作 > 制作的制造装置的流路的两侧导入TE缓冲(KCl:0.1M ；triS-HCl:10mM ；EDTA:lmM)溶液。在填充了 TE缓冲溶液后，将用于测量在流路中流动的离子电流(图4的IiJ的Ag/AgCl电极插入流路的两侧。
[0154]Ag/AgCl电极是通过在对直径0.1mm的Pt电线涂布Ag/AgCl浆料(BAS)后，以100°C加热10分钟以上而制作的。
[0155]在离子电流的测量中，对插入流路的Ag/AgCl电极的一方施加直流电压0.5V(图4的Vlmg)，将流到与该电极成对的相反侧的Ag/AgCl电极的电流(图4的IitJ经过108A/V增益的高速电流放大器并通过高速数字转换器(N1-PX1-5922)以IMHz的采样频率进行记录。需要说明的是，在该试验中，不对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极不施加直流电压(图4的 Vtrans=O)。
[0156]使用图5的实线表示通过上述试验检测的Iim的值(参照图5的Iim-Vlmg)及Isms的值(参照图5的Isms-Vtrans)。
[0157]另一方面，Iim的值理论上可通过以下的式(I)导出。即，
[0158]Iion=NKC1X μ XVlongXA/L …(I)
[0159]在上述式(I)中，Νκα表示离子浓度，μ表示离子移动度，A表示通道截面积(具体而言，与图3中的HXW对应)，L表示通道的长度(具体而言，与图3中的L对应)。并且，使用图5的虚线表示通过该式(I)理论上导出的Iim的值。
[0160]由图5可知，由实际的试验检测的Iim的值与由论理式导出的Iim的值大致一致。这表示通过〈1.控制装置的制作 > 制作的控制装置的流路被PDMS块密闭。
[0161]〈4.移动速度的测定〉
[0162]〈4-1.测定方法〉
[0163]在未对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极施加直流电压的情况、和对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极施加直流电压的情况下，对于在流路中移动的物质的移动速度会产生怎样的变化进行研究。
[0164]对于由上述〈1.控制装置的制作 > 制作的控制装置的流路，将含有生物分子的溶液经由PDMS块中开的孔，流入流路内。
[0165]具体而言，向流路的一侧导入含有IOnM浓度的λ -DNA (夕力9 才)的TE缓冲(KCl:0.1M ；triS-HCl:10mM ；EDTA:lmM)溶液，向流路的相反侧导入不含有入-DNA的TE缓冲(KCl:0.1M ；tris-HCl:10mM ；EDTA:lmM)溶液。
[0166]在填充了 TE缓冲溶液后，将Ag/AgCl电极插入流路的两侧。Ag/AgCl电极是通过在对直径0.1mm的Pt电线涂布Ag/AgCl浆料(BAS)后，以100°C加热10分钟以上而制作的。
[0167]在离子电流的测量中，对插入流路的Ag/AgCl电极的一方施加直流电压0.5V，将流到与该电极成对的相反侧的Ag/AgCl电极中的电流经过108A/V增益的高速电流放大器并通过高速数字转换器(N1-PX1-5922)以IMHz的采样频率进行记录。
[0168]〈4-2.测定结果〉
[0169]<A> 结果 I
[0170]将Ag/AgCl电极间的电压设为Vlmg=0.5V、将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间的电压设为VtMns=0V，在存在λ-DNA的条件下测量在流路中流动的离子电流(Iim)的时间变化。此外，作为对照，在不存在λ-DNA的条件下，也测量在流路中流动的离子电流(Iim)的时间变化。
[0171]在图6(a)中表示上述试验的结果。图6(a)的上侧的数据表示在不存在λ-DNA的条件下测量的离子电流(Iim)的值，图6(a)的下侧的数据表示在存在λ-DNA的条件下下测量的离子电流(Iim)的值。
[0172]如图6 (a)的上侧的数据所示，在不存在λ -DNA的条件下测量的离子电流(IitJ的值没有表现出变化，如图6 (a)的下侧的数据所示，在存在λ-DNA的条件下测量的离子电流(Iion)的值表现出以尖状减少的倾向。
[0173]上述尖状的电流的变化是由于如下原因产生的:1分子的λ -DNA在通过由相对的Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极形成的间隙部分时，阻碍沿着该间隙的离子的流动。图6 (b)是表示放大了上述尖状的电流的变化的图。
[0174]如图6 (b)所示，λ -DNA在通过由相对的Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极形成的间隙之间的期间(时间上是td(s)的期间)，Iim的值降低了 ΛΙ(ηΑ)。这表示若测定td(s)，则能够判定λ-DNA的速度的大小。S卩,表示在比较同一物质的td(S)的情况下，td(s)的值越大，物质的移动速度越慢。
[0175]需要说明的是，根据图6(b)，在将Ag/AgCl电极间的电压设为Vlmg=0.5V、将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间的电压设为Vtans=OV的情况下，td(s)的平均值为0.0005秒。
[0176]〈B〉结果 2
[0177]将Ag/AgCl电极间的电压设为Vlmg=0.5V、将Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间的电压设为Vtrans=0.5V，在存在λ -DNA的条件下测量在流路中流动的离子电流(IitJ的时间变化。
[0178]在图7(a)和(b)中表示上述试验的结果。需要说明的是，图7(b)放大了图6(a)的一部分数据。
[0179]如图7(a)和(b)所示，在对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况下，可观察两种尖状的电流的变化。若对于这些尖状的电流的变化算出td(S)的平均值，则分别为0.006秒及0.2秒。该数据表示物质的移动速度减速到未对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况的移动速度的约1/10或者约1/400。
[0180]图8表示未对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况的td(s)的值的分布、和对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况的td(s)的值的分布。需要说明的是，以图8的“I”及“II”表示的td(s)的值的分布是对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况的td(s)的值的分布。
[0181]由图7及图8可知，与未对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况相比，在对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况下可减慢物质的移动速度。进一步可知在对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加电压的情况下，可将物质的速度调节为两种移动速度。
[0182]此外，可认为上述两种速度是由于由对Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极间施加的电压产生的、流路的壁面的带电状态引起的。
[0183]如图1所示，在正极侧的流路的壁面，带负电的DNA受到静电吸引，通过DNA与电极间的静电力而使DNA的电泳速度变慢，另一方面，在负极侧的流路的壁面附近形成有溶液中的正离子(K+)的双电层，因此引起与DNA的泳动速度相反的方向的电渗流。由于该电渗流的影响，DNA的泳动速度变慢。并且，可认为由于DNA在正极或者负极中的某一侧流动，所以可观测到两种速度分布。
[0184]在此，可预测到在正极侧产生的电极与分子间的强静电相互作用、和附带的金与DNA间的分子间力所产生的效果大，因此约1/400这样大的速度的减少被认为是DNA在Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的正极侧流动的情况所产生的现象，约1/10这样的速度的减少被认为是DNA在Pt/Au/Pt/Si02纳米间隙电极的负极侧流动的情况所产生的现象。
[0185]本发明不限于以上说明的各构成，在权利要求所示的范围内可进行各种变更，将在不同的实施方式或实施例中分别公开的技术的手段适当组合而得到的实施方式或实施例也属于本发明的技术范围。
[0186]为了解决上述课题，本发明的控制方法为物质的移动速度的控制方法，具有使具有电荷的物质沿着由第一电极对形成的第一电场移动的移动步骤，其特征在于，在上述物质的移动路径的至少一部分，通过第二电极对在与上述第一电场相交的方向上形成有第二电场。
[0187]优选在本发明的控制方法中，上述第一电场的方向与上述第二电场的方向相互正交。
[0188]优选在本发明的控制方法中，上述物质在至少含有具有与上述物质所具有的电荷相反的电荷的离子的、液体或者凝胶中的至少一者中移动。
[0189]优选本发明的控制方法具有检测步骤，该检测步骤对使多个上述物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。
[0190]优选在本发明的控制方法中，上述物质为核酸、蛋白质、花粉、病毒、细胞、有机粒子或者无机粒子。
[0191]为了解决上述课题，本发明的控制装置的特征在于，具有设置于第一电极对之间的流路、和在上述流路的至少一部分设置的第二电极对，由上述第一电极对形成的第一电场的方向与由上述第二电极对形成的第二电场的方向相交。
[0192]优选在本发明的控制装置中，上述第一电场的方向与上述第二电场的方向相互正交。
[0193]优选在本发明的控制装置中，在上述流路中配置有至少含有具有与上述物质所具有的电荷相反的电荷的离子的、液体或者凝胶中的至少一者。
[0194]优选本发明的控制装置具有检测单元，该检测单元对使多个上述物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。
[0195]为了解决上述课题，本发明的确定多核苷酸的核苷酸序列的装置的特征在于，具有本发明的控制装置。
[0196]产业上的可利用性[0197]本发明可应用于需要高精度地控制物质的移动速度的领域。例如，本发明可应用于美国国立卫生研究院(NIH)所推进的更先进的下一代测序仪，且可应用于不需要利用PCR的DNA的扩增及DNA的化学修饰的更先进的下一代测序仪。另外，本发明可应用于以I分子检测流感病毒、过敏原等的生物分子的高灵敏度传感器。
【权利要求】
1.一种物质的移动速度的控制方法，具有使具有电荷的物质沿着由第一电极对形成的第一电场移动的移动步骤，其特征在于，在上述物质的移动路径的至少一部分，通过第二电极对在与所述第一电场相交的方向上形成有第二电场。
2.根据权利要求1所述的控制方法，其特征在于，所述第一电场的方向与所述第二电场的方向相互正交。
3.根据权利要求1或2所述的控制方法，其特征在于，所述物质在液体或者凝胶中的至少一者中移动，该液体或者凝胶至少含有具有与所述物质所具有的电荷相反的电荷的离子。
4.根据权利要求3所述的控制方法，其特征在于，具有检测步骤，该检测步骤对使多个所述物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。
5.根据权利要求1?4中任一项所述的控制方法，其特征在于，所述物质为核酸、蛋白质、花粉、病毒、细胞、有机粒子或者无机粒子。
6.一种具有电荷的物质的移动速度的控制装置，其特征在于，具有设置于第一电极对之间的流路和在所述流路的至少一部分设置的第二电极对，由所述第一电极对形成的第一电场的方向与由所述第二电极对形成的第二电场的方向相交。
7.根据权利要求6所述的控制装置，其特征在于，所述第一电场的方向与所述第二电场的方向相互正交。
8.根据权利要求6或7所述的控制装置，其特征在于，在所述流路中配置液体或者凝胶中的至少一者，该液体或者凝胶至少含有具有与所述物质所具有的电荷相反的电荷的离子。
9.根据权利要求8所述的控制装置，其特征在于，具有检测单元，该检测单元对使多个所述物质移动时该物质的移动速度分成多个正态分布进行检测。
10.一种确定多核苷酸的核苷酸序列的装置，其特征在于，具有权利要求6?9中任一项所述的控制装置。
【文档编号】C12Q1/68GK103492868SQ201380001058
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年1月29日 优先权日:2012年1月30日
【发明者】川合知二, 筒井真楠, 谷口正辉 申请人:国立大学法人大阪大学