用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法
【专利摘要】提供在液体洗涤剂中表现出提高的溶解度的碱性蛋白酶。由SEQ?ID?NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多序列同一性的氨基酸序列组成的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ?ID?No:2所表示的氨基酸序列的预定位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基被取代。
【专利说明】用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及用于提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白酶已经在工业领域使用很长一段时间，并应用到极为广泛种类的产品，例如 包括织物洗涤剂的洗涤剂、纤维改良剂、皮革处理剂、化妆品、沐浴盐、食品改良剂和医药产 品。其中，工业上最大量地制造的是用于洗涤剂的蛋白酶。例如，通常已知的是Alcalase、 Savinase (注册商标；Novozymes)、Maxacal (注册商标；Genencor)、BLAP (注册商标； Henkel))和 KAP(Kao Corp.)。
[0003] 将蛋白酶添加到洗涤剂的目的是使主要由蛋白质构成的、附着到衣物材料上的污 渍分解为低分子物质，从而加速表面活性剂的增溶。然而，污渍实际上是复合物，其不仅含 有蛋白质，而且含有多个组分，包括组合的有机物质和无机物质（例如源自皮脂的脂质和 固体颗粒）。然后，已经开发出对复合污渍（即不仅含有蛋白质，而且含有皮脂和其他物质） 表现出优异洗涤性能的分子量为约43, 000的碱性蛋白酶并申请了专利（参见专利文件1)。 该碱性蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶（其为常规已知的源自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶） 不同，具有不同的分子量、初级结构和酶学性质，并且与枯草杆菌蛋白酶尤其不同的是碱性 蛋白酶具有极强的抗氧化性。因此，提议将碱性蛋白酶分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚族中 (非专利文件1)。
[0004] 洗涤剂可基于其形式而分为粉末洗涤剂和液体洗涤剂。液体洗涤剂与粉末洗涤剂 相比具有优异的溶解性。液体洗涤剂具有优点，因为未稀释的液体洗涤剂可以直接施用于 污渍上。另外，近来，通过使用一半量而与常规液体洗涤剂起等同作用的液体洗涤剂（所谓 的浓缩液体洗涤剂）已市售可得。由于这样的浓缩液体洗涤剂包含在小容器内，其不需要 大的储存空间或大量用于运输的燃料。除了这些优点之外，基于洗涤机制的彻底重新考虑， 一些产品显示出改善的漂洗性能。以这种方式，可以减少洗衣所需的时间，并且可以节省所 需的水。
[0005] 为了恒定地保持含酶液体洗涤剂的预定的酶活性，需要使液体洗涤剂中溶解的酶 例如蛋白酶稳定。此外，为了增强洗涤剂的去污力，期望的是将酶尽可能多地加入到洗涤剂 中。然而，众所周知，技术上难以稳定地将酶与液体洗涤剂混合。例如，在常温下将酶储存 在液体中容易引起蛋白质的变性。此外，表面活性剂、脂肪酸、溶剂和其他物质包含在液体 洗涤剂中并且其pH为弱碱性。因此，液体洗涤剂对于酶是极其严酷的环境条件。此外，蛋 白酶是蛋白水解酶。因为该特征，蛋白酶遭受自身消化，这进一步使得难以将蛋白酶稳定地 储存在液体洗涤剂中。此外，浓缩液体洗涤剂（与常规液体洗涤剂相比是浓缩的）的低水 含量使得难以溶解大量的酶。
[0006] 作为在液体洗涤剂中稳定地保持酶活性的技术，已知的是添加酶稳定剂，例如钙 离子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸如甲酸、和多元醇。此外，已经研究了通过抑制蛋白酶活性 来克服自身消化。已经报道了通过4-取代的苯基硼酸（专利文件2)和通过某种肽醛和硼 组合物（专利文件3)可逆抑制蛋白酶而使蛋白酶稳定的方法。而且，据报道，用右旋糖酐 化学改性的蛋白酶的稳定性可以在含有表面活性剂的水溶液中得到改善（非专利文件2)。 此外，关于表面活性剂稳定性提高的蛋白酶突变体也是已知的（专利文件4至6)。
[0007] 相比之下，目前还没有开发出用于提高酶关于液体洗涤剂的溶解度的技术。
[0008] 引用列表
[0009] 专利文件
[0010] [专利文件 1]W0"/18218A
[0011] [专利文件 2] JP-A-11-507680
[0012] [专利文件 3] JP-A-2000-506933
[0013] [专利文件 4] JP-A-2009-034062
[0014] [专利文件 5] JP-A-2009-034063
[0015] [专利文件 6]W〇2〇10/l26l56A
[0016] 非专利文件
[0017] [非专利文件 1] Saeki 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.，279, 313-319, 2000.
[0018] [非专利文件 2]Cosmetics&Toiletries magazine, 111，p79_88, 1996.
【发明内容】
[0019] 更具体地，在一个实施方式中，本发明提供提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶 解度的方法，该方法包括，在由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或与其具有80%或更多 同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表 1-1和表1-2的列（i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基 酸残基用表1-1和表1-2的列（ii)中所述的氨基酸残基取代。
[0020] [表 1-1]
[0021]
【权利要求】
1. 一种提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，所述方法包括，在由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或与其具有80%或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶 中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1-1和表1-2的列（i)中所述的位置或 与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1和表1-2的列（ii)中 所述的氨基酸残基取代。 [表 1-1]
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述同一性为90%或更高。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的30位、 68位和255位或与其相对应的位置处的氨基酸残基是下面示出的氨基酸残基： 30位或与其相对应的位置：天冬氨酸； 68位或与其相对应的位置：组氨酸；以及 255位或与其相对应的位置：丝氨酸。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列 的表2的列（i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基是表2的列（ii)中所 述的氨基酸残基。 [表2]
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一个氨基酸残基包括选自 (A) 405位、（B) 81位、（C) 40位、（D) 191位和（E) 59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基 的至少一个氨基酸残基。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一个氨基酸残基包括选自 (A) 405位、（B) 81位、（C) 40位、（D) 191位和（E) 59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基 的至少两个氨基酸残基。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中选自（A)405位、（B)81位、（C)40位、 (D) 191位和（E) 59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的所述至少一个氨基酸残基被 下面所述的氨基酸残基取代： (A) 405位或与其相对应的位置：亮氨酸或色氨酸； (B) 81位或与其相对应的位置：亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸； (C) 40位或与其相对应的位置：异亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸； (D) 191位或与其相对应的位置：亮氨酸或缬氨酸；以及 (E) 59位或与其相对应的位置：缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述液体洗涤剂是包括40?90质 量％的表面活性剂的浓缩液体洗涤剂。
9. 一种突变碱性蛋白酶，其由SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列或与其具有80%或 更多同一'I"生的氨基酸序列组成，其中选自SEQ ID No:2所表不的氨基酸序列的表3-1和表 3-2的列（i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基是 表3-1和表3-2的列（ii)中所述的氨基酸残基。 [表 3-1]
10. 根据权利要求9所述的突变碱性蛋白酶，其中所述同一性为90%或更高。
11. 根据权利要求9或10所述的突变碱性蛋白酶，其中SEQ ID N〇:2所表示的氨基酸 序列的30位、68位和255位或与其相对应的位置处的氨基酸残基是下面示出的氨基酸残 基： 30位或与其相对应的位置：天冬氨酸； 68位或与其相对应的位置：组氨酸；以及 255位或与其相对应的位置：丝氨酸。
12. 根据权利要求9至11中任一项所述的突变碱性蛋白酶，其中SEQ ID N〇:2所表示 的氨基酸序列的表4的列（i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基是表4的 列（ii)中所述的氨基酸残基。
13. 根据权利要求9至12中任一项所述的突变碱性蛋白酶，其中所述至少一个氨基酸 残基包括选自（A'）405位、（B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或与其相对应的 位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基。
14. 根据权利要求9至13中任一项所述的突变碱性蛋白酶，其中所述至少一个氨基酸 残基包括选自（A'）405位、（B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或与其相对应的 位置处的氨基酸残基的至少两个氨基酸残基。
15. 根据权利要求9至14中任一项所述的突变碱性蛋白酶，其中选自（A'）405位、 (B'）81位、（C'）40位、（D'）191位和（E'）59位或与其相对应的位置处的氨基酸残基的所述 至少一个氨基酸残基被下面所述的氨基酸残基取代： (A'）405位或与其相对应的位置：亮氨酸或色氨酸； (B'）81位或与其相对应的位置：亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸或色氨酸； (C'）40位或与其相对应的位置：异亮氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸； (D'）191位或与其相对应的位置：亮氨酸或缬氨酸；以及 (E'）59位或与其相对应的位置：缬氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。
16. -种编码根据权利要求9至15中任一项所述的突变碱性蛋白酶的基因。
17. -种包括根据权利要求16所述的基因的重组载体。
18. -种包括根据权利要求17所述的重组载体的转化体。
19. 一种使用根据权利要求18所述的转化体产生突变碱性蛋白酶的方法。
20. -种包括根据权利要求9至15中任一项所述的突变碱性蛋白酶的液体洗涤剂组合 物。
【文档编号】C12N9/52GK104204201SQ201380014362
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年4月9日 优先权日:2012年4月10日
【发明者】东畑正敏, 西村祐美, 和田恭尚, 佐伯胜久, 奥田光美 申请人:花王株式会社