用于生物测定的信号放大的方法和系统的制作方法
【专利摘要】本文中公开了用于通过放大测定法检测目标分析物的方法和系统。本发明的方法和系统利用已被偶联于固体支持物(以进一步放大通过结合剂与目标分析物的相互作用产生的信号)的生物分子的高度特异性作为检测存在于样品中的低水平的目标分析物的手段。在某些实施方案中，对于其中将待鉴定的蛋白质直接或通过捕获抗体结合于钝化表面的免疫化学(例如，ELISA或RIA)或免疫荧光测定，可实现～10,000倍的放大。
【专利说明】用于生物测定的信号放大的方法和系统
[0001] 本申请要求2012年2月21日提交的美国临时专利申请61/601，244的优先权。将 美国临时专利申请61/601，244的公开内容通过引用整体并入本文。 发明领域
[0002] 本发明涉及用于生物测定法的信号放大的方法和系统。
[0003] 背景
[0004] 免疫测定是用于研究和诊断测定的重要工具。因此，存在对提高这样的测定的灵 敏度的需要。
[0005] 概述
[0006] 本发明的实施方案包括用于检测目标分析物的放大方法和用于进行这样的测定 法的试剂盒。本发明可以以多种方式体现。
[0007] 在一个实施方案中，本发明包括用于检测目标分析物的方法，其包括：向目标分析 物中添加包含固体支持物的检测支持物，所述固体支持物包含识别目标分析物并与其结合 的结合剂的多个分子；和检测在检测支持物上所述多个结合剂分子的至少一些结合剂分 子。在一个实施方案中，该方法还可包括添加捕获支持物，该捕获支持物包括至少一种捕获 载体结合剂，其识别目标分析物并与其结合以将目标分析物固定在捕获支持物上。在某些 实施方案中，该方法还可包括添加特异性识别检测支持物上所述多个结合剂分子的至少一 些并与其结合的结合剂。在一些实施方案中，可特异性识别检测支持物上所述多个结合剂 分子的至少一些并与其结合的结合剂可包含可检测部分。
[0008] 在其它实施方案中，本发明包括用于进行本文中公开的方法的试剂盒。
[0009] 附图概述
[0010] 本发明可通过参考下列非限定性附图来更好地理解。
[0011] 图1，图框A和B举例说明根据本发明的一个实施方案的一种测定法，其中图框A 描述本发明的放大免疫测定的一个实施方案，图框B描述现有技术的标准夹心免疫测定。
[0012] 图2,图框A-E举例说明用于根据本发明的可选择实施方案的目标蛋白的多种检 测法。
[0013] 详述
[0014] 定义
[0015] 除非本文中另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语具有为本领域技 术人员通常理解的含义。此外，除非另外地根据上下文要求，否则单数术语包括复数并且复 数术语包括单数。一般来说，与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和 蛋白质及核酸化学以及本文中描述的杂交结合使用的术语和所述领域的技术是本领域中 公知的和通常使用的术语和技术。除非另有指出，否则通常按照本领域中公知的和各种一 般和更专业的参考资料中描述的常规方法进行已知的方法和技术，所述常规方法在整个本 说明书中进行了讨论。按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化技术，如通常在本领域中 实现的或如本文中描述的。与本文中描述的实验室方法和技术结合使用的术语是本领域公 知的和通常使用的那些术语。
[0016] 除非另外指出，否则下列术语将被理解为具有下列含义：
[0017] 如本文中所用，除非明确地另有所指，否则术语"一个/ 一种（a) "、"一个/ 一种 (an) "和"所指物（the) "可指一个/ 一种或多个/多种。
[0018] 除非明确地表示仅指供选项或供选项共同排斥，否则术语"或"的使用用于表示 "和/或"，尽管本公开内容支持仅指供选项和"和/或"的定义。如本文中所用，"另一个" 可表示至少第二个或更多个。
[0019] 在整个本申请中，术语"约"用于表示数值包括对于装置、用于测定数值的方法的 固有误差变化或存在于样品间的变化。
[0020] 术语"固体支持物"或"支持物"意指提供生物分子可结合于其上的基底的结构。 例如，固体支持物可以是测定孔（即，例如微量滴定板），或固体支持物可以是阵列上的位 置，或可移动支持物例如珠粒。
[0021] 术语"抗体"包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体以及嵌合抗体，例如通过组 合诱变和噬菌体展示产生的。术语〃抗体〃还包括抗体的模拟物或拟肽。拟肽是基于肽 和蛋白质或从其衍生的化合物。本发明的拟肽通常可通过使用非天然氨基酸、构象限制 (conformational restraint)、电子等排取代等对已知肽序列进行结构修饰来获得。
[0022] 术语"结合剂"是指可特异性和选择性结合第二（即，不同的）目标分子的分子。 相互作用可以是非共价的，例如作为氢键合、范德瓦尔斯相互作用或静电或疏水相互作用 的结果，或其可以是共价的。术语"可溶性结合剂"是指不与固体支持物结合（即，共价地 或非共价地结合的）的结合剂。
[0023] 如本文中所用，"分析物〃是指待测量的分子或化合物。在一些实施方案中，分析 物与结合剂相互作用。如本文中描述的，术语"分析物"可指目标蛋白或肽。分析物可以是 激动剂、拮抗剂或调节剂。或者，分析物可以不具有生物作用。分析物可包括小分子、糖、寡 糖、脂质、肤、拟肤、有机化合物等。
[0024] 术语"可检测部分"或"可检测生物分子"或"报道分子"是指可在定量测定中被 测量的分子。例如，可检测部分可包括可用于将底物转化成可被测量的产物（例如，可视产 物）的酶。或者，可检测部分可以是可被定量的放射性同位素。或者，可检测部分可以是荧 光基团。或者，可检测部分可以是发光分子。或者，可使用其它可检测分子。
[0025] 如本文中所用，术语"等价带（equivalence zone) "表示其中抗原和抗体的浓度导 致最大沉淀的沉淀素反应中的区域。因此，如果抗原或抗体过量，则沉淀不发生。
[0026] 信号放大的方法
[0027] 在某些方面，本发明使用已被偶联至固体支持物以进一步放大信号的生物分子的 高度特异性作为检测存在于样品中的低水平的分析物（例如，目标蛋白）的手段。在某些 实施方案中，对于其中将待鉴定的蛋白质直接或通过捕获抗体结合于钝化表面的免疫化学 (例如，ELISA或RIA)或免疫荧光测定法，可实现至少10, 000倍的信号放大。
[0028] 因此，在某些实施方案中，本发明包括用于检测目标分析物的方法，包括将检测支 持物添加至目标分析物，所述检测支持物包含含有识别目标分析物并与其结合的结合剂的 多个分子的固体支持物；和检测存在于检测支持物上的所述多个结合剂分子的至少一些。 在某些实施方案中，该方法还包括添加捕获支持物，捕获支持物包含识别目标分析物并与 其结合（以将目标分析物固定在捕获支持物上）的至少一种捕获支持物结合剂。在一个实 施方案中，将目标分析物结合于捕获支持物，随后与检测支持物相互作用。或者，可将目标 分析物在与检测支持物相互作用后结合于捕获支持物。在某些实施方案中，该方法还可包 括添加可特异性识别检测支持物上的所述多个结合剂分子的至少一些并与其结合的结合 齐IJ。在一个实施方案中，可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分子的至少一些并与其 结合的结合剂是可溶性结合剂。
[0029] 在一个实施方案中，捕获固体支持物可以是测定孔（S卩，例如微量滴定板）。或者， 捕获固体支持物可以是阵列上的位置或可移动支持物，例如珠粒。在一个实施方案中，检测 支持物是可移动支持物例如珠粒。在某些实施方案中，目标分析物可存在于溶液中。或者， 目标分析物可以是微生物和/或组织内部的蛋白质，从而在固定后，细胞中的大分子充当 捕获支持物。例如，在一个实施方案中，免疫测定放大法可用于蛋白质的原位检测。
[0030] 在一个实施方案中，将包含特异性识别目标分析物的结合剂的多个分子的检测支 持物过量地添加至包含该目标分析物的样品中。同样地，在一个实施方案中，检测支持物包 含包含可检测部分的多个分子。或者，当使用可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分 子的至少一些并与其结合的结合剂时，可溶性结合剂可包含可检测部分。
[0031] 多种结合剂可用于本发明的方法。例如，连接于检测支持物的多个结合剂可以是 识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或可选择地，连接于捕获支持物的结合剂可 以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或可选择地，可特异性识别检测支持物 上的多个结合剂分子的至少一些并与其结合的结合剂可以是抗体或抗体片段。或者，捕获 或检测支持物的任一种上的结合剂、或可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分子的至 少一些并与其结合的结合剂可包括结合非蛋白质靶的蛋白（即，例如特异性结合小分子目 标分析物的蛋白或结合蛋白质的受体）。
[0032] 在一个实施方案中，可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分子的至少一些并 与其结合的结合剂不识别用于将目标分析物结合于捕获固体支持物的捕获结合剂。
[0033] 包含识别目标分析物的多个结合剂的检测支持物的使用提供了信号的放大。在可 选择的实施方案中，检测支持物包含超过1，〇〇〇个，或超过10, 〇〇〇个，或超过100, 〇〇〇个， 或超过500, 000个，或超过1，000, 000个特异于目标分析物的结合剂分子。因此，在一些可 选择的实施方案中，本发明的方法提供了超过在标准非放大免疫测定中看到信号的1，〇〇〇 倍，或10, 000倍，或100, 000倍，或500, 000倍，或1，000, 000倍的放大，所述标准非放大免 疫测定不包含含有多个检测结合剂的检测支持物。因此，在一些可选择的实施方案中，本 发明的方法提供了范围在于标准非放大免疫测定中看到的信号的1，〇〇〇至1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇 倍，1，000 至 100, 〇〇〇, 000 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍，或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000至500, 000倍，或50, 000至500, 000倍内的放大，所述标准非放大免疫测定不包含 含有多个检测结合剂的检测支持物。或可实现这些范围内的范围。
[0034] 在某些实施方案中，目标分析物是蛋白质，结合剂是抗体。因此，在某些实施方案 中，本发明包括用于通过免疫测定进行蛋白质检测的信号放大的方法。
[0035] 检测支持物和/或捕获支持物的使用可包括多种形式。
[0036] 例如，在一些实施方案中，可以首先将目标分析物结合于捕获支持物，随后使其与 检测支持物相互作用。因此，该方法可包括将可特异性结合目标蛋白的多个结合剂连接于 捕获支持物的步骤。该方法还可包括将目标分析物添加至捕获支持物。随后该方法可包括 向结合于捕获支持物的目标分析物中添加包含特异于目标分析物的多个检测结合剂的检 测支持物，从而所述多个检测结合剂的检测提供信号的放大。
[0037] 同样地，在某些实施方案中，该方法还可包括添加可特异性识别所述多个检测结 合剂并与其结合的第三结合剂。在一个实施方案中，可特异性识别所述多个检测结合剂并 与其结合的结合剂是可溶性结合剂。第三结合剂可包含可检测部分。因此，在一些实施方 案中，进行本方法的步骤产生由捕获支持物：捕获结合剂：目标分析物：检测结合剂：检 测支持物：可溶性结合剂：可检测部分组成的复合物。
[0038] 图1A描述了根据上述形式的本发明放大免疫测定的一个实施方案。例如，如图1A 中描述的，该方法可包括以下步骤：将多个结合剂208固定于捕获固体支持物214,以便结 合剂可特异性识别目标蛋白206并将其捕获。在一个实施方案中，该蛋白质可从细胞膜分 离或从目标细胞释放，随后被添加至固相。在一个实施方案中，连接于捕获固体支持物的捕 获结合剂是识别蛋白质的初级抗体或抗体片段。例如，在一个实施方案中，捕获支持物214 可以是用针对目标蛋白206的抗体208(例如，兔抗体）涂覆的微量滴定板孔。或者，可使 用其它结合剂例如识别特定配体的受体、可与互补序列杂交的核酸分子、识别特异性配体 的多糖、脂质、脂多糖、磷壁酸或脂磷壁酸等。固定化的抗体208可特异性识别目标分析物 206,而其它蛋白质或生物分子202、204不被结合。
[0039] 随后，可添加利用也识别目标分析物206的检测结合剂211的多个分子涂覆的检 测支持物216 (例如，珠粒）。在一个实施方案中，检测支持物可包含数千个至数万，至数 十万个检测结合剂。在一个实施方案中，检测结合剂为抗体。例如，捕获结合剂可以是识别 目标蛋白的兔抗体，而检测结合剂可以是也识别目标蛋白的豚鼠初级抗体。这样，目标蛋白 206将包含识别目标蛋白206的多个检测结合剂分子211的检测支持物216连接于固定在 捕获固体支持物214上的捕获结合剂208。
[0040] 随后，可添加识别检测结合剂211的可溶性结合剂（例如，第二抗体例如抗豚鼠抗 体）212。在一个实施方案中，利用可检测部分210 ( S卩，报道分子）标记可溶性结合剂212。 例如，可溶性结合剂可用荧光部分（例如，qDOTS?)或酶（例如，辣根过氧化物酶）标记。 或者，在一个实施方案中，第二支持物上的检测结合剂可用这样的可检测部分标记。因此， 信号的极大放大可源自单个蛋白质分子206。
[0041] 因此，如图1A中显示的，由于蛋白质206可识别一抗（即，珠粒216上的豚鼠抗体 211和捕获支持物214上的兔抗体208)，因此其可有助于珠粒216的至少一个与结合于固 体表面214的抗体208之间的夹心复合物形成。因此，在洗去任何未结合的珠粒216后，结 合于目标蛋白206的珠粒可使用识别结合于珠粒的一抗211的二抗212来检测。在一个实 施方案中，将第二抗体连接于可检测部分210例如酶、荧光基团、(JD0TS⑩等。
[0042] 因此，该方法可包括将多个结合剂固定于固体支持物（"捕获支持物"）的步骤，以 便结合剂可特异性识别目标分析物并捕获其。随后，该方法可包括添加利用数万个第二结 合剂（"检测支持物"）涂覆的可移动第二支持物（例如，珠粒），所述第二结合剂可特异性 结合固定在第一支持物上的至少一个分子。该方法还可包括添加第三结合剂-报道分子复 合物（例如，偶联至可检测部分的可溶性结合剂）的步骤，所述复合物特异性结合第二支持 物上的所述多个第二结合剂的至少一些。随后该方法可包括检测由捕获支持物：捕获结合 齐IJ :目标分析物：检测结合剂：检测支持物：可溶性结合剂：可检测部分组成的复合物的 步骤。如图1A中举例说明的，由于存在大量连接于检测支持物216的结合剂分子211 (其 可结合具有报道分子210的可溶性结合剂212)，因此信号（S卩，结合于捕获支持物214上的 结合剂208的蛋白206)的放大得到极大增强。
[0043] 图1B提供了用于比较的现有技术内非放大免疫测定的图解说明。因此，图1B的免 疫测定包括包含捕获支持物214:第一一抗208:目标分析物206:第二一抗211:二抗212: 可检测部分210的夹心的形成。
[0044] 图2举例说明可用于检测目标分析物的放大免疫测定的几个可选择的实施方案， 在所述测定中可改变将不同组分添加至测定法内的顺序。
[0045] 如图2A(方法1)中显示的，在一些实施方案中，可将目标分析物结合于捕获结合 剂230,随后将捕获结合剂连接于捕获支持物240。随后，可添加包含多个检测结合剂211 的检测支持物233。最后，添加包含可检测部分210并识别检测结合剂211的可溶性结合剂 212。
[0046] 例如，在一个实施方案中，添加特异于目标分析物206 (例如，目标蛋白）并用生物 素205标记的一抗230的分子（例如，兔）以结合溶液中的分析物分子206。生物素化抗 体230可特异性识别目标分析物206,而其它蛋白质或生物分子202、204不被结合。在该点 上，可添加磁性链霉抗生物素蛋白-涂覆的"捕获"珠粒（或珠粒）240 (例如，直径约1微 米）以定量地结合生物素化抗体-蛋白质复合物。在一个实施方案中，该方法可包括通过 添加生物素和牛血清白蛋白（BSA)来封闭珠粒-蛋白质复合物。
[0047] 在该点上，添加利用数千至数万，至数十万个第二种一抗211的分子（所述抗体识 别目标蛋白206,但在与生物素化捕获抗体230不同的物种例如豚鼠中产生）涂覆的"检测" 珠粒或多个珠粒233以结合分析物206上开放的未被占据的表位。检测抗体211的量可使 用识别第二一抗211 (例如针对豚鼠一抗的抗-豚鼠抗体）的二抗212来检测。在一个实施 方案中，二抗212用可检测部分210进行标记。例如，二抗可用荧光部分（例如，tJDOTS? )或酶（例如，辣根过氧化物酶）进行标记。因此，信号的极大放大可源自单个蛋白质分子。
[0048] 图2B (方法2)举例说明了方法1的放大测定法的可选择形式，但其中将包含检测 结合剂分子211的检测支持物或支持物233添加至具有捕获结合剂230的测定孔，随后添 加识别捕获结合剂230的捕获支持物240。一旦捕获支持物：捕获结合剂：目标分析物： 检测结合剂：检测支持物的复合物形成，就可添加利用可检测部分210标记的可溶性结合 齐[J 212的分子。
[0049] 图2C(方法3)举例说明了方法1的测定法的可选择形式，但其中包含多个检测结 合剂211的检测支持物或支持物233还包含连接于（例如，通过共价附着或涂覆表面）检测 支持物的表面而非结合于分开的可溶性结合剂的可检测部分210的多个分子。在一个实施 方案中，如果检测支持物包含多个可检测部分，则该方法可允许使用更少的检测结合剂。例 如，检测支持物上的可检测部分：检测结合剂的比例可以为1:1，或5:1，或10:1，或100:1， 或500:1,或1000:1或10, 000:1或更大。可检测部分可包含荧光部分（例如，QD0TS? ) 或酶（例如，辣根过氧化物酶）。同样地，可看出在该实施方案中，不需要使用可特异性识别 检测支持物上的所述多个结合剂分子的至少一些并与其结合的结合剂（例如，可溶性抗体 212)。
[0050] 图2D (方法4)举例说明了方法3的测定法的可选择形式，但其中在添加捕获支持 物240之前，添加利用检测结合剂211涂覆的检测支持物或支持物233和多个可检测部分 210。在一些实施方案中，同时添加利用检测结合剂211涂覆的检测支持物233以及多个可 检测部分210和捕获结合剂230。在一个实施方案中，这可促进目标分析物206和检测支持 物233与捕获结合剂230之间的复合物形成。
[0051] 图2E (方法5)举例说明了方法2的可选择形式，但其中在添加捕获结合剂230和 捕获支持物240之前添加检测支持物233。在一个实施方案中，这可促进目标分析物206与 检测支持物233之间的复合物形成。
[0052] 可能非常重要的是可特异性识别检测支持物上的所述多个结合剂分子的至少一 些和/或检测结合剂并与其结合的结合剂不结合捕获支持物或捕获支持物结合剂，因为这 样的结合可导致本底。因此，在某些实施方案中，检测的步骤包括添加识别检测珠粒上的检 测一抗试剂的可溶性二抗，但其中可溶性二抗不识别用于将目标蛋白结合于捕获支持物的 捕获结合剂（例如，第 抗）。
[0053] 在某些实施方案中，捕获和/或检测固体支持物可利用钝化剂处理。例如，在某些 实施方案中，可将目标分析物捕获在钝化的表面（即，经处理而减少非特异性结合的表面） 上。一种这样的钝化剂为BSA。此外和/或可选择地，当使用的结合剂是抗体时，可用蛋白 A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或以高亲和力结合结合剂抗体的另一种试剂涂覆捕获和/或检 测固体支持物。这些蛋白质结合抗体的Fc结构域，从而可使识别目标蛋白的抗体的结合定 向。
[0054] 检测和/或捕获支持物可以是聚苯乙烯珠粒或由相似的或其它材料制造的珠粒， 以便珠粒可用蛋白质涂覆，但不与测定中的其它组分反应。在某些实施方案中，珠粒是充 分大的，从而多个抗体分子可被连接于珠粒。例如，珠粒在尺寸上直径可从〇. 1 μ m变化至 50 μ m，或从0· 2 μ m变化至40 μ m，或从0· 3 μ m变化至30 μ m，或从1 μ m变化至20 μ m，或 从1变化至15或约从1变化至3 μ m的范围内。珠粒的尺寸可取决于待进行的测定法的尺 寸。对于在微量滴定孔中进行的测定法，可使用约1微米（μπι)的珠粒。
[0055] 在可选择的实施方案中，检测支持物可包含多个检测结合剂。例如，在可选择的实 施方案中，检测支持物上结合剂的数量可以是超过1〇〇个，或超过500个，或超过1，000个， 或超过5, 000个，或超过10, 000个，或超过20, 000个，或超过50, 000个，或超过100, 000 个，或超过500, 000个，或超过1，000, 000个分子的检测结合剂。例如，在一个实施方案中， 检测支持物可包含利用数万或数十万个抗体分子涂覆的珠粒。在可选择的实施方案中，对 于直径约为15 μ m的检测支持物珠粒，可存在约10, 000至10, 000, 000个，或约50, 000至 500, 000个，或约100, 000至1，000, 000个结合剂分子（例如，一抗）。对于具有不同尺寸 的检测支持物珠粒，可使用对应的表面覆盖度。或者，可实现在这些范围内的范围。
[0056] 如上所述，可将与酶或荧光材料（qDOTS?或其它荧光标记）复合的结合剂添加 至用作检测支持物上的检测结合剂的大量抗体。免疫化学（例如，ELISA)测定或荧光材料 的激发和可视化（在适当的发射成像系统中）可用于定量蛋白质。在一个实施方案中，关 于大的信号放大倍数的关键是可容纳检测结合剂的结合的检测支持物的大表面积。例如， 对于抗体，可将约>10, 〇〇〇和>100, 〇〇〇个分子用于分别涂覆1 μ m和2. 8 μ m的珠粒。
[0057] 被捕获支持物上的目标分析物的分子占据的面积应当满足至检测支持物的表面 的可达性。例如，充当捕获支持物并且具有1 μ m尺寸的1，000, 000个珠粒的二维汇合阵列 (confluent array)可占据约1mm2。在一个实施方案中，可将包含106个分子的目标分析物 的样品的系列稀释物用于固定化（例如，微量滴定孔）捕获支持物，以便为每一个样品应用 产生单独的位置。对于可移动捕获支持物（例如，珠粒），可结合的具有特定尺寸的检测支 持物的数量可受到位阻效应限制。对于固定或可移动支持物，可结合被>1〇 4或>1〇5个一抗 涂覆的1 μ m或2. 8 μ m珠粒的目标分析物的各分子可通过ELISA、RIA或免疫荧光测定在标 记二抗结合后分别提供在该范围内的放大。
[0058] 例如，在一个实施方案中，本发明可包括在间接免疫化学或免疫荧光测定中使信 号放大?10, 〇〇〇倍的方法，包括：将用蛋白A/G和>10, 000个特异于待鉴定的蛋白质的抗 体分子涂覆的聚苯乙烯检测珠粒（直径通常为1微米）连接于以适当的间隔固定（直接或 通过特异性捕获抗体）在钝化的表面上或固定在捕获珠粒上的蛋白质分子；通过洗涤除去 未结合的珠粒-抗体复合物；结合与例如酶或荧光材料((JD0TS?)或其它荧光标记复合的 二抗；和通过例如ELISA或通过荧光材料的激发和可视化（在适当的发射成像系统中）定 量蛋白质。
[0059] 此外和/或可选择地，目标分析物可存在于溶液中，并且测定法可包括使分析物 将多个检测支持物连接在一起作为检测分析物的装置。例如，可将溶液中的蛋白质用于连 接多个检测珠粒（例如，直径约15至20 μ m)、检测珠粒各自具有多个抗体，从而通过对两 个珠粒上的抗体的结合促进珠粒凝集。当使用多克隆抗血清（这样的抗血清将允许抗体识 别目标蛋白上的不同表位）时，这可以特别有效。可测试蛋白质的系列稀释物的最大珠粒 凝集，以确定抗体-珠粒和蛋白质的最佳浓度，即等价带。抗体过量的前带效应（prozone effect)是不可能的，因为抗体被固定在珠粒上。
[0060] 在另一个实施方案中，当目标分析物在微生物内或组织样品内时，可将样品中的 细胞浓缩至具有适当孔径的过滤器（例如，对于细菌，通常地0. 45 μ m的旋转过滤器）的表 面上。浓缩后，可在小体积的缓冲液（如本文中描述的）中裂解它们，以释放目标分析物的 分子。可将包含目标分析物的细胞裂解物从过滤器表面转移至载玻片或微量滴定板的孔 中。在该点上，目标分析物（例如，蛋白质）可通过在添加?300至?1，000个大的（通常 直径15至20 μ m)用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G和特异性抗体涂覆的聚苯乙烯珠粒后网格的 形成来鉴定。珠粒凝集可直接看到或借助50至100倍的放大来看到。再次地，抗体在珠粒 上的固定可消除前带效应；然而，可能需要与恒定数量的珠粒-抗体复合物混合的蛋白质 的系列稀释物来观察因可能的抗原过量导致的珠粒凝集。与已知量的目标分析物聚集（凝 集）的珠粒-蛋白G-抗体复合物可用作阳性对照，无任何目标分析物（例如，来自已知的 阴性对照的裂解物）的缓冲液中的未聚集珠粒-蛋白G-抗体复合物可用作阴性对照。
[0061] 用于信号放大的试剂念
[0062] 在可选择的实施方案中，本发明可包括进行本发明的方法的试剂盒。在一个实施 方案中，本发明可包括用于测定目标分析物的试剂盒，其包括检测支持物，所述检测支持物 包含含有可识别目标分析物并与其结合的多个结合剂分子的固体支持物。在一个实施方案 中，试剂盒可包括捕获支持物，该捕获支持物包含识别目标分析物并与其结合的至少一种 捕获支持物结合剂。在一些实施方案中，试剂盒还可包含可特异性识别检测支持物上的多 个结合剂分子并与其结合的结合剂。在一个实施方案中，可特异性识别检测支持物上的多 个结合剂分子并与其结合的结合剂是可溶性结合剂。
[0063] 检测和/或捕获支持物可包括多种形式。在一个实施方案中，捕获固体支持物可 以是测定孔（即，例如微量滴定板）。或者，捕获固体支持物可以是阵列上的位置，或可移动 支持物例如珠粒。在一个实施方案中，检测支持物是可移动支持物例如珠粒。
[0064] 多种结合剂可用于本发明的试剂盒。例如，所述多个连接于检测支持物的结合剂 分子可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段的分子。此外和/或可选择地，连接于捕获 支持物的结合剂可以是识别目标分析物的抗体或抗体片段。此外和/或可选择地，可特异 性识别检测支持物上的多个结合剂分子并与其结合的结合剂可以是抗体或抗体片段。在实 施方案中，可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分子并与其结合的结合剂不识别用于 将目标分析物结合于捕获固体支持物的捕获结合剂。或者，捕获或检测支持物任一者上的 结合剂，或可特异性识别检测支持物上的多个结合剂分子并与其结合的结合剂可包括结合 非蛋白质靶的蛋白（即，例如特异性结合小分子目标分析物的蛋白或结合蛋白质的受体）。 [0065] 检测支持物可包含多个分子的可检测部分。此外和/或可选择地，可特异性识别 检测支持物上的多个结合剂分子并与其结合的结合剂可包含可检测部分。
[0066] 包含多个识别目标分析物的结合剂的检测支持物的使用提供了信号的放大。在 可选择的实施方案中，检测支持物可包含多个检测结合剂。例如，在可选择的实施方案中， 检测支持物上的结合剂的数量可以是超过100个，或超过500个，或超过1，000个，或超过 5, 000个，或超过10, 000个，或超过20, 000个，或超过50, 000个，或超过100, 000个，或超 过500, 000个，或超过1，000, 000个分子的检测结合剂。例如，在一个实施方案中，检测支 持物可包含用数万或数十万个抗体分子涂覆的珠粒。在可选择的实施方案中，对于直径约 为15 μ m的检测支持物珠粒，可存在约10, 000至10, 000, 000个或约50, 000至500, 000个， 或约100, 000至1，000, 000个结合剂分子（例如，一抗）。对于具有不同尺寸的检测支持物 珠粒，可使用对应的表面覆盖度。或者，可达到这些范围内的范围。
[0067] 因此，在可选择的实施方案中，本发明的方法提供了为在标准非放大免疫测定中 看到的信号的1，〇〇〇倍，或超过10, 〇〇〇倍，或超过100, 〇〇〇倍，或超过500, 000倍，或超过 1，000, 000倍放大，所述非放大免疫测定不包括包含多个检测结合剂的检测支持物。例如， 在可选择的实施方案中，本发明的试剂盒提供了范围在于标准非放大免疫测定中看到的信 号的 1，000 至 1，000, 000, 000 倍，或 1，000 至 100, 000, 000 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍， 或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000 至 500, 000 倍，或 50, 000 至 500, 000 倍内的放大，所 述非放大免疫测定不包括包含多个检测结合剂的检测支持物。或者，可达到这些范围内的 范围。
[0068] 因此，在某些实施方案中，试剂盒可包括用于基于珠粒的免疫测定法的试剂。因 此，在一个实施方案中，检测支持物可包含用识别目标蛋白的抗体（或抗体片段）的分子 涂覆的珠粒。在某些实施方案中，珠粒可以是蛋白G、蛋白A或蛋白A/G涂覆的聚苯乙烯珠 粒，其可在多种尺寸上商购获得（例如，Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad CA)。 可能有用的其它珠粒包括用这些相同蛋白涂覆的磁性二氧化娃珠粒（来自AmsBio, Lake Forest, CA 的 MagSi 珠粒）·
[0069] 在可选择的实施方案中，对于直径约为15μπι的检测支持物珠粒，可存在约 10, 000 至 10, 000, 000 或约 50, 000 至 1，000, 000,或约 100, 000 至 500, 000 个结合剂分子 (例如，一抗）。对于具有不同尺寸的检测支持物珠粒，可使用对应的表面覆盖度。在某些 实施方案中，检测支持物珠粒充分大，从而可将多个结合剂分子连接于珠粒。例如，珠粒在 尺寸上直径可从约0· 1 μ m变化至50 μ m，或从0· 2 μ m变化至40 μ m，或从0· 5 μ m变化至 30 μ m，或从1 μ m变化至20 μ m，或从1 μ m变化至15 μ m或从约1 μ m变化至3 μ m。当待连 接于珠粒的结合剂是抗体时，可使用利用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G预涂覆的商购可得的珠 粒，因为这些蛋白结合抗体的Fc结构域，从而将抗体定向，使得Fab结构域自由用于结合抗 原的表位。
[0070] 用于基于珠粒的免疫测定法的试剂盒还可包括针对目标蛋白的另外的一抗，其中 这样的抗体来自第二物种。这些抗体在如本文中描述的间接测定中具有特殊功用，因为它 们可容纳第二抗-抗体-报道分子复合物的特异性结合。此外，这些二抗-报道分子复合 物将不结合来自第一物种的一抗，所述一抗将靶蛋白固定于固体表面或蛋白A/G珠粒上， 从而消除假阳性反应。此外，二抗-报道分子复合物不结合蛋白A/G珠粒的表面，从而消除 假阳性反应。
[0071] 试剂盒还可包含可用可检测标志物或可与可检测标志物复合的结合剂进行标 记的可溶性二抗。例如，在某些实施方案中，本发明的试剂盒可包含结合于荧光基团的 二抗。在一个实施方案中，突光基团可包括QD0T⑩。例如，在一个实施方案中，抗-抗 体-QD0T?缀合物识别多个珠粒-结合的一抗。
[0072] 待用于本发明的试剂盒的基底包括但不限于聚苯乙烯珠粒 (Spherotech, Libertyville, 111.)、磁性珠粒（Invitrogen ;AmsBio)、胶乳涂层、薄膜滤 器、纤维滤器、不溶解纤维（free fiber)或多孔固体基底。磁性珠粒的使用方法（例如，对 于 Dynabeads Protein G Prod. No. 10003D 的包装说明书）可见于 Kala 等人，Analytical Biochemistry254:263_266(1997)和Dutton, Genetic Engineering News,第22卷，Number 13, July 2002 中。
[0073] 具有宽范围尺寸的一系列颗粒，特别地磁性和聚苯乙烯珠粒是可商购获得的。对 于某些实施方案，优选的一组颗粒具有约1微米（即，微米）的平均粒度（即，最大颗粒 尺度）。对于某些实施方案，优选的一组颗粒具有不小于10微米（即，微米）的平均粒度 (即，最大颗粒尺度）。示例性的商购可得的珠粒是可从Invitrogen, Carlsbad, CA或从 Spherotech, Libertyville, 111获得的蛋白G、蛋白A和蛋白A/G-涂覆的聚苯乙烯珠粒和 链霉抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠粒。聚苯乙烯和磁性珠粒的其它提供商包括Thermo Scientific Pierce,Millipore, Polyscience 和 New England Biolabs。AmsBio, Lake Forest, IL是磁性二氧化硅珠粒的提供商，对于上文中给出的所有蛋白质涂层，所述二氧化 娃珠粒是可获得的。Invitrogen还提供了环氧树脂表面磁性珠粒，其共价地结合抗体。珠 粒可以是聚苯乙烯、二氧化硅、玻璃或其它材料的平面或经衍生用于连接至特定化学基团。 实施例
[0074] 本发明的实施方案还可通过下列非限定性实例来说明。
[0075] 实施例1:利用基于珠粒的信号放大检测蛋白质
[0076] 可利用固定在钝化表面的对于目标蛋白（例如，生物素化兔一抗）是特异性的抗 体例如中性抗生物素蛋白（Neutravidin)捕获目标蛋白质或蛋白质亚单位，以使假阳性减 少至最少（例如，参见Jain等人，Nature, 2011，473:484-488)。随后，在夹心测定中，添加 用蛋白A/G和特异于在第二物种（例如，豚鼠）中产生的蛋白质的另一种类型抗体（对于 1 μ m和2. 8 μ m珠粒通常>104和>105个）涂覆的1 μ m或2. 8 μ m聚苯乙烯珠粒以结合固 定的靶蛋白亚单位。随后添加缀合于（例如，共价地结合于）酶、放射性标记或荧光材料例 如gDOTs?的二抗或抗体片段（例如，抗-豚鼠抗体），以结合多个特异于目标分析物的珠 粒-结合的一抗。通过在连续的添加之间进行洗涤（2次）来除去未结合的蛋白质分子或 抗体。
[0077] ELISA、RIA或免疫荧光测定可用于检测和定量目标蛋白或蛋白质亚单位。为了测 定荧光，用UV光激发点，随后在超光谱成像系统中，利用适当的发射滤光片，使用照相机使 点可视化。
[0078] 实施例2:使用珠粒放大的各种形式捕获核糖体蛋白
[0079] 进行实验以比较图2的图框B(S卩，方法2)中描述的各种测定形式。基本上，通 过裂解细菌细胞，将其中的核糖体在6M(10, 000个细胞/ μ 1)异硫氰酸胍中分解成蛋白质 组分来制备大肠杆菌（E.coli)裂解物（500, 000个细胞）。随后通过稀释入磷酸盐缓冲液 (例如，将90, 000个细胞稀释至450 μ 1)将异硫氰酸胍浓度降至0. 12或0. 6M。随后使用 图2中显示的捕获检测法（表1)之一捕获核糖体蛋白。显示了最初输入的细胞和来自细 胞的被评估的核糖体蛋白的结果；100个大肠杆菌细胞具有约2. 7pg的核糖体蛋白。
[0080]
【权利要求】
1. 一种用于信号放大的方法，包括： 将包含固体支持物的检测支持物添加至目标分析物，所述固体支持物包含识别目标分 析物并与其结合的结合剂的多个分子；和 检测在检测支持物上的所述多个结合剂分子中的至少一些。
2. 权利要求1的方法，其中所述检测支持物为珠粒。
3. 权利要求1的方法，其中所述检测支持物包含可检测部分的多个分子。
4. 权利要求1的方法，还包括添加捕获支持物，所述捕获支持物包含识别所述目标分 析物并与其结合以将所述目标分析物固定在捕获支持物上的至少一个捕获支持物结合剂。
5. 权利要求4的方法，其中在与所述检测支持物相互作用之前将所述目标分析物结合 于所述捕获支持物。
6. 权利要求4的方法，其中在与所述检测支持物相互作用之后将所述目标分析物结合 于所述捕获支持物。
7. 权利要求1的方法，还包括添加可特异性识别所述检测支持物上的多个结合剂分子 的至少一些并与其结合的结合剂。
8. 权利要求7的方法，其中所述可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分 子的至少一些并与其结合的结合剂包含可检测部分。
9. 权利要求4的方法，其中所述捕获支持物为珠粒。
10. 权利要求4的方法，其中连接于捕获支持物的结合剂是可识别所述目标分析物并 与其结合的抗体或抗体片段。
11. 权利要求1的方法，其中连接于检测支持物的所述多个结合剂分子为识别所述目 标分析物并与其结合的抗体或抗体片段。
12. 权利要求7的方法，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分子 的至少一些并与其结合的结合剂为抗体或抗体片段。
13. 权利要求7的方法，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分子 的至少一些并与其结合的结合剂不识别用于将所述目标分析物结合于所述捕获固体支持 物的捕获结合剂。
14. 权利要求7的方法，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分子 的至少一些并与其结合的结合剂包括可溶性结合剂。
15. 权利要求1的方法，其中所述检测支持物包含超过10, 000个特异于所述目标分析 物的结合剂分子。
16. 权利要求1的方法，其中所述检测支持物包含超过100, 000个特异于所述目标分析 物的结合剂分子。
17. -种用于测定目标分析物的试剂盒，其包括：检测支持物，所述检测支持物包含含 有可识别所述目标分析物并与其结合的多个结合剂分子的固体支持物。
18. 权利要求17的试剂盒，其还包括捕获支持物，所述捕获支持物包含识别所述目标 分析物并与其结合的至少一个捕获支持物结合剂。
19. 权利要求17的试剂盒，其还包括可识别所述检测支持物上的多个结合剂并与其结 合的结合剂。
20. 权利要求19的试剂盒，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分 子的至少一些并与其结合的结合剂包括可溶性结合剂。
21. 权利要求17的试剂盒，其中所述检测支持物为珠粒。
22. 权利要求17的试剂盒，其中所述检测支持物包含多个可检测部分分子。
23. 权利要求17的试剂盒，其中连接于检测支持物的所述多个结合剂分子是可识别所 述目标分析物并与其结合的抗体或抗体片段。
24. 权利要求18的试剂盒，其中所述捕获支持物为珠粒。
25. 权利要求18的试剂盒，其中所述捕获支持物结合剂是可识别所述目标分析物并与 其结合的抗体或抗体片段。
26. 权利要求19的试剂盒，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分 子的至少一些并与其结合的结合剂是可识别所述目标分析物并与其结合的抗体或抗体片 段。
27. 权利要求19的试剂盒，其中可特异性识别所述检测支持物上的所述多个结合剂分 子的至少一些并与其结合的结合剂包含可检测部分。
28. 权利要求17的试剂盒，其中所述检测支持物包含超过1，000个特异于所述目标分 析物的结合剂分子。
29. 权利要求17的试剂盒，其中所述检测支持物包含超过10, 000个特异于所述目标分 析物的结合剂分子。
30. 权利要求17的试剂盒，其中所述检测支持物包含超过100, 000个特异于所述目标 分析物的结合剂分子。
【文档编号】C12Q1/70GK104245960SQ201380017257
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月21日 优先权日:2012年2月21日
【发明者】D·L·安德森, A·J·康拉德, S·E·埃里克森, B·B·霍普金斯 申请人:美国控股实验室公司