新的卷曲乳杆菌菌株的制作方法

新的卷曲乳杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及标示为IP174178且在编号I–464下保藏于CNCM的分离的卷曲乳杆菌菌株或与IP174178具有相同特征的分离的菌株。本发明还涉及包含此类菌株的药物组合物或营养食品组合物，及其用于治疗或预防生殖器感染的用途。
CNCM I-4646
20120622
【专利说明】新的卷曲乳杆菌菌株 发明领域
[0001] 本发明涉及从健康组织的样品分离的新的特定卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)菌株和具有相同特征的任何菌株及包含其的组合物。
[0002] 在健康女性中，泌尿生殖器菌群包含几乎50种不同的微生物物种。在这些微生物 中，95%的群体由各种乳杆菌菌株（包括"德德莱因氏杆菌（D6derlein'sbacillus)"） 组成。这些乳杆菌通过多种机制有助于针对病原体提供保护，所述机制包括生成过氧化 氢，乳酸和细菌素，抑制病原体的粘附和扩散。特别地，这些乳杆菌通过从阴道粘液中 存在的糖原生成乳酸而维持酸性pH。因此，阴道菌群的多种病原体，诸如阴道加德纳氏 菌（Gardnerellavaginalis)、二路普雷沃氏菌（Prevotellabivia)、淋病奈瑟氏球菌 (Neisseriagonorrhoeae)、支原体（mycoplasmas)、动弯杆菌属（Mobiluncus)和最重要的 白色念珠菌（Candidaalbicans)的生长受到抑制。
[0003] 因此，正常的阴道菌群主要由在粘膜表面上形成保护性生物膜的乳杆菌构成。特 别地，阴道中最常观察到的乳杆菌是卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌（Lactobacillusjensenii)、 阴道乳杆菌（Lactobacillusvaginalis)、惰性乳杆菌（Lactobacillusiners)和加氏乳杆 菌（Lactobacillusgasseri)〇
[0004] 外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginalcandidiasis)影响70 - 75%的女性，在其生 育年份期间至少一次受到影响，并且约40 - 50%会具有第二例事件。复发性外阴阴道念珠 菌病的发生率（定义为每年至少4例事件，包括通过真菌学检查确认的2例）已经评估为 5 - 8%。此种良性疾病对患者的生命质量具有非常负面的影响，并且产生相当大的健康护 理花费。此类病理学由于此疾病的多因素发病机制而难以治疗。
[0005] 使用口服或阴道抗真菌剂的传统维持疗法必须持续至少6个月，但是复发率仍然 较高，其中60 - 70%的女性在治疗中断后2个月中复发。此外，抗真菌剂具有常见的副作 用，并且其长期使用可以促进细菌性阴道炎的发生。
[0006] 细菌性阴道炎是由于正常阴道菌落的定性和定量失调所致，其可以导致乳杆菌的 实际上完全消失，导致厌氧性菌群受益，而且还导致细菌诸如参与细菌性阴道炎的阴道加 德纳氏菌和阴道阿托波氏菌（Atopobiumvaginae)的出现。
[0007] 细菌性阴道炎是具有10至15的频率的最常见阴道感染之一。女性中的此种良性 病理学在妊娠期间可以是严重的，因为它可以引起早产、低出生重量和自发性流产。
[0008] 细菌性阴道炎和阴道微菌群的其它失调通常通过抗生素疗法治疗。此治疗具有抗 生素治疗的典型缺点，并且正在证明是效果越来越小的。此外，其目的为消除病原性菌群， 但还破坏正常的有益菌群。
[0009] 发明背景
[0010] 已经描述了有益的乳杆菌的口服或阴道施用促进阴道健康并且治疗生殖器感染。 特别地，专利申请W0 84/04675、W0 2000/035465、US2002/0044926 和W0 2006/045475 描 述了乳酸细菌的口服或阴道施用促进阴道健康并且预防外阴阴道念珠菌病的复发。
[0011] 优选的乳杆菌是鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus)和德德莱因氏杆菌 (阴道嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilusvaginalis))。专利US6, 093, 394、US6, 468, 526和US7, 807, 440以及专利申请US2010/0151026描述了特定卷曲乳杆菌菌株的 施用。
[0012] 在这些菌株中，可以提到下列卷曲乳杆菌菌株：
[0013] -在DSMZ(德国）在保藏号DSM16735、16736、16738、16739、16740、16741、16742 和16743下保藏的卷曲乳杆菌菌株，如记载于专利申请EP1 824 500的；这些菌株能够定 殖阴道粘膜，如此能够促进阴道健康；它们还对上皮细胞具有良好的粘附特性；
[0014] -在CNCM(法国）在保藏号I- 3483、I- 3484和I- 3486下保藏的卷曲乳杆菌菌 株，如记载于专利申请EP1 812 023的；针对其粘附上皮细胞的能力选择这些菌株；它们 展现出对胃环境的酸性pH的良好抗性，及得到证明的抗病原性效果；
[0015] -在BCCM/LMG(比利时）在保藏号P- 20558下保藏的卷曲乳杆菌菌株，如记载于 专利EP1 427 808B1的；此菌株与其它乳酸菌株组合使用，要借助于棉塞（tampon)施用， 此菌株具有能够定殖阴道腔的能力，包括在月经期间；和
[0016] -在ATCC(USA)在保藏号202225下保藏的卷曲乳杆菌菌株，如记载于专利EP1 011 721B1的；此菌株展现出对上皮细胞的良好粘附，较长的存活力（特别是在存在此文 件中描述的保存基质的情况下）、及良好的乳酸和H202生成。
[0017] -卷曲乳杆菌的p- 17631菌株，如记载于专利申请EP949 330,其能够发酵糖原 并抑制念珠菌（Candida)的生长。
[0018] 大多数这些益生菌菌株（从来自健康女性的阴道样品分离）不能在酸性pH环境 中存活或幸免于与胆汁的延长接触。
[0019] 阴道pH是在女性一生中显著变化的一项参数：生理pH在青春期前女孩中是7,在 青春期女性中下降到3. 8,并且在绝经期期间（缺乏激素替换疗法）大于5. 5。这些变化与 多种因素，诸如雌激素的存在和乳杆菌的定殖相关。
[0020] 因此，对于外源施用的益生菌菌株重要的是能够耐受阴道腔的酸性生理pH，此外 还能够耐受口服施用期间胃腔的pH。
[0021] 此外，许多这些菌株不能使用糖原作为可发酵碳的来源（MartinR.等，2008)。然 而，此特性是有利的，因为阴道粘膜通常缺乏葡萄糖，并且益生菌菌株的乳酸生成仅可以在 存在可发酵碳的来源的情况下得到维持。
[0022] 发明概述
[0023] 本发明涉及在CNCM于2012年6月22日以登录号CNCMI- 4646下保藏的新的分 离的卷曲乳杆菌菌株，标示为IP174178,以及具有相同特征的任何卷曲乳杆菌菌株。
[0024] 在下文的说明书中，对卷曲乳杆菌IP174178的任何提及会指此菌株及具有相同 特征的任何卷曲乳杆菌菌株。
[0025] 此新的菌株IP174178具有以下的结构特征：
[0026] -它在需氧-厌氧条件中生长；
[0027] -其rep-PCR概况（profile)在图 1 中呈现；
[0028] -其16S核糖体DNA的序列以SEQIDNO: 1呈现。
[0029] 其主要的功能特性是：
[0030]-其较高的H202和乳酸生成速率（超过7g/升）；
[0031]-其依靠糖原作为唯一碳底物生长的能力；
[0032]-其对胆汁的抗性；
[0033]-其对酸性pH(特别是2. 5-4的pH)的抗性；
[0034]-其抑制泌尿生殖器区的病原体形成的能力。
[0035] 特别地，菌株卷曲乳杆菌IP174178具有对酸性pH的抗性。
[0036] 更特别地，菌株卷曲乳杆菌IP174178具有对胆汁及对酸性pH的抗性。
[0037] 更特别地，菌株卷曲乳杆菌IP174178具有对胆汁及对酸性pH的抗性，并且能够代 谢糖原。
[0038] 本发明还涉及药物组合物，其包含单独的或与其它益生菌菌株或其它活性成分组 合的至少1〇 9个CFU的此菌株卷曲乳杆菌IP174178。
[0039] 本发明还涉及此菌株IP174178用于预防和治疗复发性或非复发性生殖器和泌尿 生殖器感染的用途。
[0040] 发明详述
[0041] 本发明涉及标示为IP174178且在登录号I-4646下保藏于CNCM的新的分离的卷 曲乳杆菌菌株，及与此分离的菌株具有相同特征的任何分离的卷曲乳杆菌菌株。
[0042] 术语"乳杆菌"指所有乳杆菌细菌，是革兰氏阳性细菌（不能移动，具有可变的形 状和大小），和兼性厌氧菌。大多数乳杆菌将乳糖和其它单糖转化成乳酸。它们存在于阴道 和胃肠道中，并且它们构成肠和阴道菌群的重要组成。
[0043] 卷曲乳杆菌在欧洲、美国和日本是阴道菌群的优势种类之一（Antonio,MAD 等，1999)。
[0044] 分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178具有下列功能特性：
[0045] _较高的H202和乳酸生成（超过7g/升）；
[0046]-依靠糖原（由阴道粘膜分泌的内源底物）生长的能力；
[0047] -对酸性pH和对胆汁的抗性；
[0048]-抑制病原体形成的能力；
[0049]-对阴道上皮细胞的粘附。
[0050] 此种依靠糖原生长的能力是相对罕见的，并且对于意图在生殖道中形成的菌株是 特别有利的，在生殖道中葡萄糖经常是缺乏的，且在那里唯一的碳源是糖原。如此，即使在 缺乏葡萄糖的情况下此菌株的乳酸生成也得到维持（参见表5)。
[0051] 耐受酸性pH的能力是一种高度有利的特征，因为在一个方面，它容许根据本发明 的菌株在口服施用时抵抗胃的PH，且在另一个方面，在女性生殖道中即使在异常酸性分泌 的情况下也能繁殖。
[0052] 抵抗胆汁的能力使得有可能设想此菌株的口服施用，而不仅仅是阴道施用。
[0053] 本发明还涉及包含菌株卷曲乳杆菌IP174178的药物组合物。
[0054] 在根据本发明的组合物中，每克组合物的细菌数目优选大于108,且特别是 1〇 8_1〇1(1。根据本发明的一个典型的方面，组合物包含至少1〇9个CFU的卷曲乳杆菌菌株。 术语"CFU"指"菌落形成单位"，并且是本领域技术人员公认为量化能够建立菌落的细菌的 量度单位。
[0055] 优选地，卷曲乳杆菌菌株是冻干的。菌株可以是组合物的唯一冻干成分，但是优选 地，菌株在包含冻干步骤之前或之后添加的其它组分的培养基中冻干。
[0056] 根据本发明的另一个典型的方面，药物组合物进一步包含本领域技术人员公知的 保存基质和/或赋形剂，和任选地具有补充作用的其它活性成分。
[0057] 根据本发明的一个典型的方面，组合物为粉末形式，其可以置于胶囊中，或者其可 以并入任何合适的载体类型，诸如乳剂或营养食品（nutraceutical)组合物中。
[0058] 特别地，此组合物可以包含下列活性成分：激素和/或抗炎剂和/或杀细菌剂和/ 或抗真菌剂。本领域技术人员会能够确定哪些活性成分可以与菌株卷曲乳杆菌IP174178 有利结合。
[0059] 根据本发明的一个优选的方面，组合物包含硫代硫酸钠，优选地浓度为至少 l〇〇mg/克包含108_101(1个CFU的卷曲乳杆菌IP174178的粉末。以下实施例例示了称作"配 制剂A"的组合物，其包含冻干前的113g/l硫代硫酸钠，及最终230mg硫代硫酸钠/g粉末。 硫代硫酸钠的存在使得有可能加强菌株IP174178的抗病原性效果（参见表6C)。
[0060] 根据本发明的组合物还可以包含其它乳杆菌菌株。
[0061] 根据本发明，药物组合物可以配制用于阴道施用或口服施用。特别地，对意图口服 施用的细菌测试其对胆汁的抗性、对酸性pH的抗性及其在存在胆汁的情况下生长的能力。 创造性的菌株IP174178具有使其能够口服施用的这些特征。
[0062] 对于供口服施用的药物组合物，合适的配制剂特别是片剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液 和口服悬浮液。
[0063] 对于供阴道施用的药物组合物，合适的配制剂特别是乳剂、胶囊和阴道栓剂和棉 塞。
[0064] 特别地，根据本发明的组合物意图用于治疗生殖器和泌尿生殖器感染，诸如阴道 病（vaginosis)和念珠菌病。
[0065] 术语"阴道病"指阴道的微生物菌群的失调。其特征在于乳杆菌消失和病原性细 菌诸如上文所列的那些细菌的繁殖。
[0066] 术语"念珠菌病"指由念珠菌属（Candida)酵母引起的阴道感染。
[0067] 这些感染与病原体，特别是属于白色念珠菌、阴道加德纳氏菌、支原体或动弯杆菌 属家族的病原体的存在相关。
[0068] 白色念珠菌是念珠菌属的最重要且最知名的酵母物种。它主要对消化和生殖器粘 膜引起真菌感染（念珠菌病（candidiasis,candidosis))。
[0069] 阴道加德纳氏菌是一种具有多形杆菌（pleomorphicrod)或球杆菌形状的细菌。 它是一种通常存在于阴道病（非特异性阴道炎）病例中的细菌，作为唯一的病原性细菌或 与其它细菌组合存在。它生成仅影响人细胞的穿孔毒素。
[0070] 术语"支原体"指对靶向细胞壁的抗生素家族（青霉素或P-内酰胺）不敏感的 超过100个细菌物种的家族。特别地，生殖道支原体（Mycoplasmagenitalium)造成生殖 器和泌尿生殖器感染（尿道炎、宫颈炎、阴道炎、输卵管炎）和不育问题。
[0071] 动弯杆菌属是一种经常与细菌性阴道病中的阴道加德纳氏菌一起找到的厌氧性 革兰氏阳性细菌。
[0072] 本发明还涉及营养食品组合物，其包含菌株卷曲乳杆菌IP174178,或具有相似特 征的菌株。此类营养食品组合物会以食物组合物或食物补充物形式提供。
[0073] 食物组合物会由菌株卷曲乳杆菌IP174178构成，该菌株优选是冻干的，与食物产 品诸如乳制品、脂肪、含有谷类的产物、糖果或饮料混合。
[0074] 特别地，在本发明的背景中，食物补充物可以以明胶或植物物质的软胶囊或胶囊 形式提供。
[0075] 本发明还涉及包含如上文描述的组合物之一的医学装置，此医学装置特别是阴道 棉塞，抹刀（spatula)、卫生棉、生殖器肥皂，等等。
[0076] 本发明还涉及分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178用于预防和治疗生殖器和泌尿生 殖器感染诸如阴道病和念珠菌病的用途。
[0077] 可以根据建立适合于患者的药物治疗中一般考虑的标准，诸如例如患者的年龄或 重量，患者一般状态的严重性（thegravityofthepatient'sgeneralstate)、对治疗 的耐受性和观察到的副作用，确定根据本发明的组合物的最佳施用模式、剂量给药日程表 和剂量形式。分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178会以局部（阴道）施用和口服施用两者使 用，单独或组合涵盖这两种施用类型。
[0078] 根据本发明的另一个方面，使用分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178来维持无感染 的女性中的有益阴道菌群。
[0079] 根据本发明的又一个方面，使用分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178在抗生素治疗 后恢复有益的阴道菌群。
[0080] 如此，本发明涉及包含分离的菌株卷曲乳杆菌IP174178的药物组合物，其用于维 持或恢复有益的阴道菌群。
[0081] 附图简述
[0082] 图1 :比较通过r印-PCR得到的基因型概况的树状图形式的图示。
[0083] 图2 :比较通过r印-PCR得到的基因型概况的相似性矩阵形式的图示。
[0084] 图3 :菌株IP174178对阴道上皮细胞的粘附的测试。 实施例
[0085] 实施例1 :菌株卷曲乳杆菌IP174178的分离和选择
[0086] 对从健康女性分离的10个菌株应用7种测试，并且对其预先选择其生成过氧化氢 (H202)的能力。这些测试是：在改良的MRS培养基（ManJC等，1960)中生长，生成H202的 能力，生成乳酸的能力，对阴道细胞系的细胞的粘附，抑制某些生殖器病原体的能力（盘抑 制法（diskinhibitionmethod))和甲硝咕唑（metronidazole)抗性。
[0087] 在这第一批测试后，鉴定为特别感兴趣，特别是在其较高的H202和乳酸生成上特 别感兴趣的三个菌株是在存在糖原的情况下的生长测试的对象，仅菌株IP174178具有使 用糖原（其是阴道粘膜分泌的内源底物）作为碳源的能力。另外，此菌株在存在胆汁的情 况下展现出最佳的生长。
[0088] 获得的结果如下：
[0089] 表1 :菌株IP174178的最后一项选择测试
[0090]
【权利要求】
1. 一种分离的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus)菌株，其标示为IP174178且在 登录号I - 4646下保藏于CNCM。
2. -种药物组合物，其包含根据权利要求1的菌株。
3. 根据权利要求2的药物组合物，其包含至少10 9个CFU的所述菌株。
4. 根据权利要求2或3中一项的药物组合物，其进一步包含保存基质（preservation matrix)和任选地其它活性成分。
5. 根据权利要求2至4中任一项的药物组合物，其进一步包含硫代硫酸钠。
6. 根据权利要求2至5中任一项的药物组合物，其配制用于阴道施用或用于口服施用。
7. 根据权利要求2至6中任一项的组合物，其用于治疗和预防生殖器和泌尿生殖器感 染，诸如阴道病（vaginosis)和念珠菌病（candidiasis)。
8. -种含有根据权利要求7的组合物的医学装置，特别是阴道塞（vaginal tampon)。
9. 一种营养食品组合物,其包含根据权利要求1的菌株。
10. 根据权利要求2至6中任一项的药物组合物，其用于维持或恢复有益的阴道菌群 (flora)〇
【文档编号】C12N1/20GK104508117SQ201380036919
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年7月9日 优先权日:2012年7月9日
【发明者】A.尼沃利兹 申请人:S.P.M.D公司