作为基因表达诱导剂的糖酯的制作方法

文档序号:467566阅读:269来源:国知局
作为基因表达诱导剂的糖酯的制作方法
【专利摘要】本发明提供了新颖糖酯,特别是二糖酯,及其制备方法。这些化合物可用作微生物培养基组分以用于在微生物发酵过程中诱导基因表达。
【专利说明】作为基因表达诱导剂的糖酯
[0001] 相关申请案的夺叉引用
[0002] 本申请案要求2012年7月20日申请的美国临时申请案序列号61/673, 997和2012 年12月27日申请的61/746, 120的权益,所述临时申请案的内容全文并入。
[0003] 关于联邦政府咨助研究的声明
[0004] 依据美国农业部的授权书第#2012-33610-19542号,美国政府拥有本申请案中的 某些权力。

【技术领域】
[0005] 本发明涉及在细胞培养中用作基因表达诱导剂的化合物及其制备方法。更确切地 说,本发明涉及对于酶制造商来说能显著降低制造成本的低成本而且高效的蛋白质诱导剂 的开发。

【背景技术】
[0006] 便宜而且容易获得的工业酶是工业生物技术革命背后的关键推动因素,其中越来 越多地使用可再生资源以生物学方式产生化学物质和能量燃料。与用于治疗和诊断目的的 高利润酶或其它蛋白质相反,工业酶典型地具有较低利润,并且在发酵后利用有限的下游 加工大量制造。对于工业酶市场来说,生产成本对商业上的成功是至关重要的。为了满足 可再生化学物质和能源工业对较便宜而且容易获得的酶的日益增加的需求,急需更有效而 且成本有效的生产工艺。
[0007] 主要工业酶制造商都把大量产能投入到真菌发酵,特别是使用丝状真菌,例如曲 霉属(Aspergillus spp)、青霉属(Penicillium spp)、木霉属(Trichoderma spp.)、拉克悼 金抱菌(Chrysosporium lucknowense) (Cl)和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila) (重新分类),以制造纺织品、洗涤剂、食品和饲料以及新兴生物燃料工业中所使用的众多 酶产品(沙玛(Sharma)等人,世界微生物学与生物技术杂志(World J. of Microbiol, and Biotech. ),25(12) :2083-2094(2009);维瑟(Visser)等人,工业生物技术(Industrial Biotech. ),7(3):214-223(2011))。
[0008] 在曲霉属和木霉属中大批生产相关蛋白质通常需要能在强天然启动子下活化转 录开关从而驱动相关基因表达靶酶或蛋白质的诱导剂化合物。例如淀粉和纤维素等不溶性 底物通常用于实验室规模下以便分别诱导曲霉属和木霉属中的蛋白质表达。然而,其在工 业规模下的实施因不良底物连贯性和材料和在大规模下所遭遇的例如灭菌、馈料、混合和 粘度问题等处理问题而受阻。因此,在大批生产酶和其它蛋白质时,高效可溶性诱导剂是更 优选的。
[0009] 麦芽糖、异麦芽糖和麦芽糊精通常用作可溶性诱导剂以用于在曲霉属中 诱导α -淀粉酶和葡糖淀粉酶(巴顿(Barton)等人,细菌学杂志(J. Bacteriol. ,b (3) :771-777 (1972)),而槐糖、纤维二糖和乳糖是广泛用于木霉属中的酶生产工业的 三种有效的可溶性诱导剂(库比切克(Kubicek)等人,生物燃料生物技术(Biotech. Biofuels), 2:19(2009))。槐糖,S卩一种 β 1,2-二糖,被视为里氏木霉(Trichoderma reesei)中的纤维素酶基因启动子的最强诱导剂,活性是纤维二糖的2500倍(曼德尔斯 (Mandels)等人,细菌学杂志(J. Bacteriol. ),83(2) :400-408 (1962))。这些相应的可溶性 诱导剂都在诱导之前、期间或之后由曲霉属或木霉属代谢。因此,它们被视为无偿诱导剂, 因而需要在发酵期间不断供应它们以便实现最佳诱导。
[0010] 在通过深层发酵进行的工业酶生产中,可溶性诱导剂通常呈单独或补充有例如葡 萄糖等替代性碳源的馈入批料形式以碳受限方式供应至发酵器。由于诱导剂是有偿的,故 诱导过程如果未经充分优化则通常将导致会显著降低生产率的分解代谢物阻遏以及会显 著降低产率的非必需生长。因而,所属领域中需要更强的无偿或接近无偿的诱导剂,其能消 除诱导受非意料抑制、生长或其它生理功能影响,从而允许进行更严格的过程优化,以便与 当前可能达到的相比显著提高生产率和产率。更强的诱导剂还能容易地用于满足对更便宜 而且非诱导性原料的诱导需要以及增强例如乳糖、纤维素、麦芽糊精等常规诱导剂或例如 淀粉和纤维素水解物等更便宜替代物以及例如固相发酵等替代生产过程中的诱导。
[0011] 因为基于糖的诱导剂对于蛋白质表达来说既是诱导剂又是阻遏剂,所以通过对 诱导剂进行改性以减缓其吸收或新陈代谢来增强诱导力的方法是已知的。尽管未加以表 征,但已知八乙酸纤维二糖酯水解产物的诱导力优于纤维二糖(曼德尔斯和里斯(Reese), 细菌学杂志(J. Bacteriol. ),79(6) :816-826(1960))。在产糖芽霉菌(Pullularia pullulans)中,单棕榈酸蔗糖酯所诱导的蔗糖酶产率是蔗糖的80倍(里斯等人,细菌学 杂志,100(3) :1151-1154(1969))。类似地,乙酰基纤维二糖在产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)中诱导纤维素酶时比葡萄糖或纤维二糖更有效,其中单-0-乙酰基纤维二 糖是所测试的最具活性的诱导剂(苏乔(Suto)等人,发酵与生物工程杂志(J. Ferment. Bioengin. ),72(5) :352-357(1991))。本发明人的最近申请(国际申请第 WO 2013/003291 号)公开了由对天然槐糖脂进行稀酸处理而得到的一类新颖槐糖酯,天然槐糖脂的诱导力 为槐糖本身的至少30倍。


【发明内容】

[0012] 在一个方面,本发明提供了一种用于产生相关蛋白质的方法,其包含提供发酵宿 主和将所述发酵宿主与碳源和一或多种选自由以下各项组成的群组的化合物一起培养:

【权利要求】
1. 一种用于产生相关蛋白质的方法,其包含: a) 提供发酵宿主;和 b) 将所述发酵宿主与碳源和一或多种选自由以下各项组成的群组的化合物一起培 养:

其中R^H或C(O)R; Rb是H或C(O)R; R。是H或C(O)R; Rd是H或C(O)CH3; RgH或C(O)CH3; 心是H或C(O)CH3; &是!1 或C(0)CH3 ;且 R是脂肪族部分,其限制条件是在式(II)中,当艮是H或C(0)CH3且Rb是H或C(0)CH3 时,R。是H, 其中所述发酵宿主是在足以产生相关蛋白质的条件下加以培养。
2. 根据权利要求1所述的方法,其中向所述培养物中加入任选的常规诱导剂。
3. 根据权利要求2所述的方法,其中所述任选的常规诱导剂包含乳糖、纤维二糖、槐 糖、纤维素、纤维素水解物、麦芽糖、异麦芽糖、麦芽糊精、淀粉或淀粉水解物。
4. 根据权利要求1所述的方法,其中所述相关蛋白质是纤维素酶或淀粉酶。
5. 根据权利要求1所述的方法,其中所述相关蛋白质是同源或异源蛋白质。
6. 根据权利要求5所述的方法,其中所述同源或异源蛋白质是酶、激素、生长因子、细 胞因子或抗体。
7. 根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵宿主能够产生纤维素酶或淀粉酶。
8. 根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵宿主是丝状真菌或细菌或选自由以下 各项组成的菌属群组的其它宿主:木霉属(Trichoderma)、腐殖菌属(Humicola)、侧耳菌 属(Pleurotus)、镜刀菌属(Fusarium)、曲霉属(AspergiIlus)、链霉属(Streptomyces)、 嗜热单抱霉属(Thermomonospora)、牙胞杆菌属(Bacillus)、纤维杆菌属(Cellulomonas)、 青霉属(Penicillium)、担子菌属(Basidiomycete)、金孢属(Chrysoporium)、拟盘多毛 抱属(Pestalotiopsis)、脉抱菌属(Neurospora)、头抱霉属(Cephalosporium)、绵霉属 (Achlya)、柄孢壳菌属(Podospora)、内座壳属(Endothia)、毛霉属(Mucor)、旋孢腔菌 属(Cochliobolus)、毁丝霉属(Myceliophthora)、篮状菌属(Talaromyces)和梨抱菌属 (Pyricularia)ο
9. 根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵宿主是丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)或黑曲霉(Aspergillusniger) 〇
10. 根据权利要求1所述的方法,其中使所述发酵宿主在液体培养基中或在无自由流 动液体的固体底物上生长。
11. 根据权利要求1所述的方法,其中所述发酵宿主具有与编码相关蛋白质的基因可 操作地连接的启动子。
12. 根据权利要求11所述的方法,其中所述启动子是纤维素酶基因启动子或淀粉酶基 因启动子。
13. 根据权利要求11所述的方法,其中所述启动子是cbhl启动子或glaA启动子或 amyA启动子。
14. 根据权利要求1所述的方法,其中所述碳源是生物质。
15. 根据权利要求14所述的方法,其中所述生物质是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乳糖、 纤维素、纤维素水解物、淀粉、淀粉水解物、麦芽糖或麦芽糊精。
16. 根据权利要求1所述的方法,其中所述式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)化合物是 从得自于化学催化或酶催化的转酯化反应的粗产物混合物分离。
17. 根据权利要求1所述的方法,其中所述式(VI)化合物是从天然内酯型槐糖脂的甲 酸处理过程分离。
18. 根据权利要求1所述的方法,其中所述式(VII)化合物是从酵母假丝酵母菌 (Candidabombicola)的培养物分离。
19. 根据权利要求1所述的方法,其中R是选自未经取代的C^C24烷基、经取代的C^C24 烷基、未经取代的C2-C24烯基和经取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
20. 根据权利要求1所述的方法,其中R是选自经羟基取代的C1-C24烷基和经羟基取代 的C2-C24烯基的脂肪族部分。
21. 根据权利要求1所述的方法,其中R是选自经羧基取代的C1-C24烷基和经羧基取代 的C2-C24烯基的脂肪族部分。
22. 根据权利要求1所述的方法,其中R是选自经芳香族基团取代的C1-C24烷基和经芳 香族基团取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
23. 根据权利要求1所述的方法,其中所述式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)和 (VII)化合物包含: K
U
其中Rt^H或C(O)CH3;RgH或C(O)CH3; 心是H或C(O)CH3; 且心是!1或C(0)CH3。
24. -种用于产生一或多种式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)化合物的方法, 其包含: a) 提供 >糖;和 b) 使所述二糖与乙烯酯在脂肪酶存在下在溶剂系统中接触。
25. 根据权利要求24所述的方法,其中所述二糖包含乳糖、槐糖、纤维二糖、麦芽糖或 异麦芽糖。
26. 根据权利要求24所述的方法,其中所述脂肪酶包含Novozyme435、LipozymeTL、 LipozymeRM或Amano脂肪酶PS。
27. 根据权利要求24所述的方法,其中所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸 乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亚油酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯或硬 脂酸乙烯酯。
28. 根据权利要求24所述的方法,其中所述溶剂系统包含与叔戊醇、叔丁醇、四氢呋 喃、丙酮、甲醇或乙腈混合的极性溶剂。
29. 根据权利要求24所述的方法,其中所述极性溶剂包含二甲亚砜(DMSO)、吡啶或二 甲基甲酰胺(DMF)。
30. 根据权利要求24所述的方法,其还包含加热到40°C至100°C之间的温度。
31. 根据权利要求24所述的方法,其还包含进行真空蒸馏以去除所述溶剂系统和分离 相关产物。
32. -种用于产生一或多种式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)或式(V)化合物的方法, 其是通过适当的二糖与合适的乙烯酯在溶剂系统中进行酸或碱催化的转酯化反应来进行。
33. 根据权利要求32所述的方法,其中所述碱是碳酸钾(K2C03)、氢氧化钠(NaOH)或氢 氧化钾(KOH)。
34. 根据权利要求32所述的方法,其中所述酸是硫酸(H2SO4)或盐酸(HCl)。
35. 根据权利要求32所述的方法,其中所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸 乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亚油酸乙烯酯、棕榈酸乙烯酯或硬 脂酸乙烯酯。
36. 根据权利要求32所述的方法,其中所述溶剂系统包含诸如二甲亚砜(DMSO)、吡啶 或二甲基甲酰胺(DMF)等极性溶剂。
37. -种用于产生一或多种式(VI)化合物的方法,其包含: a) 在实质上非水性条件下使天然内酯型槐糖脂与甲酸或乙酸反应;和 b) 部分或完全去除所形成的甲酸酯或乙酸酯。
38. 根据权利要求37所述的方法,其中所述使天然槐糖脂与甲酸或乙酸反应步骤是由 第二种酸催化。
39. 根据权利要求37所述的方法,其中所述第二种酸包含硫酸(H2SO4)或盐酸(HCl)。
40. 根据权利要求37所述的方法,其中所述天然槐糖脂是由发酵宿主产生。
41. 根据权利要求40所述的方法,其中所述发酵宿主是假丝酵母菌。
42. 根据权利要求37所述的方法,其中所述实质上非水性条件包含水含量不超过约 10 %的反应混合物。
43. 根据权利要求37所述的方法,其还包含在所述部分或完全去除所形成的甲酸酯或 乙酸酯步骤之前在40°C至120°C之间的温度下进行加热的步骤。
44. 根据权利要求37所述的方法,其中所述去除所形成的甲酸酯包含在乙酸和甲醇中 回流。
45. 根据权利要求37所述的方法,其中所述去除所形成的乙酸酯包含用酸或碱进行处 理。
46. -种由发酵宿主产生一或多种式(VII)化合物的方法。
47. 根据权利要求46所述的方法,其中所述发酵宿主是假丝酵母菌。
48. 根据权利要求46所述的方法,其中所述式(VII)和(Vila)化合物是从得自于假丝 酵母菌培养物的粗混合物分离。
49. 一种用于产生槐糖的方法,其包含: a) 在实质上非水性条件下使天然槐糖苷与甲酸反应;和 b) 完全去除所形成的甲酸酯; 其中获得了经过纯化的槐糖。
50. 根据权利要求49所述的方法,其中所述天然槐糖苷是甜菊苷、槐糖脂和类黄酮槐 糖苷。
51. 根据权利要求49所述的方法,其中所述使天然槐糖苷与甲酸反应步骤是由第二种 酸催化。
52. 根据权利要求51所述的方法,其中所述第二种酸包含硫酸(H2SO4)或盐酸(HCl)。
53. 根据权利要求49所述的方法,其中所述实质上非水性条件包含水含量不超过约 10 %的反应混合物。
54. 根据权利要求49所述的方法,其还包含在所述完全去除甲酸酯步骤之前在40°C至 120 °C之间的温度下进行加热的步骤。
55. 根据权利要求49所述的方法,其中完全去除甲酸酯包含在溶剂中用碱进行处理。
56. 根据权利要求55所述的方法,其中所述碱是甲醇钠(CH3NaO)或氨(NH3),且所述溶 剂是甲醇或乙醇。
57. -种具有式(II)结构的化合物,
其中: RgH或C(O)R; Rb是H或C(O)R; Rc^H或C(O)R;且 R是脂肪族部分,其限制条件是当R#H或C(0)CH3且Rb是H或C(0)CH3时,R。是H。
58. 根据权利要求57所述的化合物,其中R是选自由以下各项组成的群组:未经取代 的C1-C24烷基;经羟基、羧基或芳香族基团取代的C^C24烷基;未经取代的C2-C24烯基;和经 羟基、羧基或芳香族基团取代的C2-C24烯基。
59. 根据权利要求57所述的化合物,其中R是选自未经取代的C^C24烷基、经取代的 C1-C24烷基、未经取代的C2-C24烯基和经取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
60. 根据权利要求57所述的化合物,其中R是选自经羟基取代的C^C24烷基和经羟基 取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
61. 根据权利要求57所述的化合物,其中R是选自经羧基取代的C^C24烷基和经羧基 取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
62. 根据权利要求57所述的化合物,其中R是选自经芳香族基团取代的C^C24烷基和 经芳香族基团取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
【文档编号】C12P21/00GK104471071SQ201380037346
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2012年7月20日
【发明者】汤姆·涛·黄 申请人:索芙洛生物技术公司
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