伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：编码伪狂犬病毒gI蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。本发明还公开了一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的制备方法和应用。本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，对伪狂犬病毒有较好的免疫保护效果，适于作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。
【专利说明】伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊 髓炎为主要特征的一种烈性传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、 贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳 仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链 DNA，长约150kb，由长独特区（UL)、短独特区（US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多 种蛋白。病毒粒子由核衣壳、外壳及囊膜三层组成。核衣壳是由6种衣壳蛋白包裹病毒基 因组形成的二十面体结构；外壳介于核衣壳与囊膜层间，由14种蛋白组成；囊膜由15种蛋 白镶嵌于双层脂膜组成，其中糖蛋白11种。病毒表面蛋白决定了病毒的细胞嗜性，也是主 要的保护性抗原。一些重要的病毒基因，如tk，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒 致弱。
[0003] 伪狂犬最早发生于美国，我国于上世纪40年代末在猫中首次发现了 PRV，60年代 初在猪群中也出现了该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪 群的健康，并造成了严重经济损失。猪感染PRV后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒；出现 临床症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，这增加了 PRV防治的难度。为了控 制PRV，我国猪场自上世纪末开始广泛使用PRV弱毒活疫苗，如PRVBartha株活疫苗，猪伪狂 犬发病率明显下降。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪 产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武、彭金美等人也分 别从发病猪中分离到了 PRV野毒株，并通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离的野 毒株较疫苗株和经典毒发生了较大的变异。这表明，我国猪场中出现了 PRV变异株，而目前 使用的商品化疫苗对变异株的保护效果差，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头。为了有 效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的PRV疫苗。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决目前国内出现PRV变异株，而现有商品化PRV疫苗对变异株保护效 果差，亟需开发新的PRV疫苗的技术问题，提供一种伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该基因缺 失弱毒株对PRV变异株具有较好的免疫保护效果，接种2周龄内仔猪，不出现PRV临床症 状，安全性高，适于作为防治伪狂犬病的疫苗候选株。
[0005] 此外，还需要提供一种上述伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的制备方法和应用。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0007] 在本发明的一个方面，提供了 一种伪狂犬病毒弱毒株，该弱毒株是伪狂犬病毒的 基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：编码伪狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸 (SEQ ID NO. 2)的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸（SEQ ID NO. 3)的核苷酸序列。
[0008] 优选的，所述弱毒株缺失的基因序列包括：伪狂犬病毒gl基因第594-1101位碱基 的核苷酸序列、以及伪狂犬病毒gE基因第1-1212位碱基的核苷酸序列。
[0009] 更优选的，所述弱毒株缺失的基因序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。由SEQ ID NO. 1缺失基因序列可知，本发明的伪狂犬病毒弱毒株，包含伪狂犬病毒gl基因的第1至 593位碱基和gE基因的第1213至1740位碱基，不含有伪狂犬病毒基因组中gl基因的第 594至1101位碱基、gE基因的第1至1212位碱基、以及gl基因和gE基因之间的103bp连 接序列，即不含有伪狂犬病毒基因组中gl基因的第594位碱基至gE基因的1212位碱基间 的DNA序列（共计缺失1823bp，如SEQ ID NO. 1所示）。在508bp (第594至1101位碱基） 的gl基因缺失序列中，第1个碱基即gl基因第594位的"C"为编码脯氨酸（P)的第三个 碱基，其余507个碱基的最后3个碱基是终止密码子。
[0010] 在本发明的另一方面，提供了一种重组载体，该重组载体包含伪狂犬病毒gl基因 和gE基因的部分序列，其中不包含以下基因序列：编码伪狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨 基酸的核苷酸序列、以及编码伪狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
[0011] 优选的，所述重组载体还包含CMV启动子控制下的绿色荧光蛋白基因（EGFP基 因)，用于筛选基因缺失的重组伪狂犬病毒。
[0012] 在本发明的另一方面，还提供了一种伪狂犬病毒弱毒株的制备方法，包括以下步 骤：
[0013] (1)构建上述重组载体，该重组载体还包含有EGFP荧光标记基因；
[0014] ⑵提取伪狂犬病毒总DNA，将该总DNA与步骤⑴的重组载体共转染细胞，获得 含EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒；
[0015] (3)构建上述重组载体，该重组载体不包含EGFP荧光标记基因；
[0016] (4)提取步骤（2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤（3)的重组 载体共转染细胞，获得不包含EGFP突光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为伪
[0017] 在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用 载体混合的伪狂犬病毒弱毒株。
[0018] 所述疫苗组合物适于滴鼻、注射接种。
[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种上述伪狂犬病毒弱毒株在制备预防或治疗伪 狂犬病的疫苗中的应用。
[0020] 在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的 检测试剂盒，包含：针对SEQ ID NO. 1所示缺失基因序列设计的引物对。利用设计合成的引 物对，通过PCR扩增反应，能区分鉴别出本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株与野毒株。
[0021] 在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的 检测试剂盒，包含伪狂犬病毒gE蛋白抗体。通过检测感染猪体的gE抗体，能够区分鉴别出 本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株与野毒株的感染。
[0022] 本发明的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，接种11日龄仔猪，不出现临床症状，安全 可靠，能作为有效防治伪狂犬病的疫苗候选株。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0024] 图1是本发明实施例1的pBIE-GFP质粒构建路线图；
[0025] 图2是本发明实施例1改造好的pXEGFP-C3质粒Nhe I和Xho I双酶切鉴定结 果图；
[0026] 图3是本发明实施例1左右重组臂的PCR结果图；
[0027] 图4是本发明实施例1的pBIE-GFP质粒用Sac I和Nhe I、Nhe I和Xba I、 Xba I和Xho I分别进行双酶切鉴定结果图；
[0028] 图5是本发明实施例1构建的转移载体用不同的转染试剂转染BHK-21细胞后24h 的荧光显微镜观察结果图；
[0029] 图6是本发明实施例2PRV JS-2012-AgI/gE-EGFP毒在纯化过程中不同代次在 荧光显微镜下的结果图；
[0030] 图7是本发明实施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒不同接毒剂量下的蚀斑形 态；
[0031] 图 8 是本发明实施例 2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP 毒用 gBup/gBdown 引物的 PCR 鉴定结果图；
[0032] 图 9 是本发明实施例 2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP 毒用 gEup/gEdown 引物的 PCR 鉴定结果图；
[0033] 图10是本发明实施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用glU/gID引物的PCR鉴 定结果图；
[0034] 图11是本发明实施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用gEU/gED引物的PCR鉴 定结果图；
[0035] 图12是本发明实施例2PRV JS-2012- Λ gl/gE-EGFP毒用glU/gED引物的PCR鉴 定结果图；
[0036] 图13是本发明实施例3pBIE质粒的构建路线图；
[0037] 图14是本发明实施例3PRV JS-2012- Λ gl/gE毒接种细胞后在荧光及自然光下 的病变图；
[0038] 图15是本发明实施例3PRV JS-2012- Λ gl/gE毒用glU/gED弓丨物的PCR鉴定结 果图；
[0039] 图16是本发明实施例4PRV JS-2012- Λ gl/gE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后体 温的变化图；
[0040] 图17是本发明实施例4PRV JS-2012- Λ gl/gE疫苗毒及其亲本毒接种仔猪后的 死亡结果统计图。
【具体实施方式】
[0041] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物 学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京： 科学出版社，2004)中所述的方法进行。
[0042] 由于现有的猪伪狂犬病毒疫苗不能对目前流行的伪狂犬病毒变异毒株提供较好 的免疫保护效果，因此有必要研制PRV新型疫苗。本发明通过将伪狂犬病毒强毒株PRV JS-2012的gl基因及gE基因的部分基因进行缺失，获得毒力致弱的伪狂犬病毒基因缺失疫 苗PRV JS-2012-AgI/gE。该疫苗对仔猪具有较好的安全性。有望作为基因工程标记弱毒 疫苗应用于对伪狂犬病毒变异株的防治。
[0043] 在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：
[0044] 病毒和细胞：BHK-21细胞（美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为：CCL-10)， Vero细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，保藏号为：GN010)，伪狂犬病毒 JS-2012株（本实验室保存；发表文章见：童武，张青占，郑浩，刘飞，姜一峰，单同领，周艳 君，童光志.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学报，2013， 21(3) : 1-7)。
[0045] 质粒与菌株：pEGFP-Nl、pEGFP_C3和pBluescript SK(+)购自上海基音生物技术 有限公司；大肠杆菌DH5ci感受态；购自北京天根。
[0046] 其他试剂：MEM 和 DMEN, Invitrogen 公司产品；Asel、SacI、Xhol、Seal 和 T4DNA连接酶，NEB公司产品；Fugene HD转染试剂，promega公司产品；DNA片段小量 快速回收试剂盒，Omega 公司；2XGC Buffer II，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq， DL-15000，DL-2000DNA Marker购自TakaRa;其它化学试剂均是进口或国产分析纯。
[0047] 在本发明的实施例中，BHK-21细胞的培养方法如下：
[0048] BHK-21细胞在含有10%FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后， 弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0. 25%的胰酶将细胞消化下，加入新的含有 10%FBS的MEM培养基，以1:8的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
[0049] 在本发明的实施例中，Vero细胞的培养方法如下：
[0050] Vero细胞在含有10%FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后， 弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0. 25%的胰酶将细胞消化下，加入新的含有 10%FBS的DMEM培养基，以1:6的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。
[0051] 实施例1PRV JS-2012gI/gE基因缺失转移载体pBIE-GFP的构建
[0052] 通过PCR方法，扩增出位于PRV JS-2012基因组中121632至123031位碱基和 124854至126372位碱基的两条片段，用作同源重组的左、右重组臂。同时，通过内切酶酶 切，从PEGFP-C3质粒中切出CMV启动子-EGFP基因片段，从pEGFP-Nl质粒中切出SV40po 1 yA 信号序列片段，并将左重组臂-CMV启动子-EGFP基因-SV40polyA信号序列-右重组臂依 序组装于pBluescript SK(+)载体中，获得了重组转移载体pBIE-GFP。具体构建过程如下 (参见图1):
[0053] 1. 1引物设计
[0054] 根据PRV JS-2012株的全基因组序列，用01ig〇6. 0软件设计了 2对引物PRELF/ PRELR与PRERF/PRERR(见表1)，用于来扩增同源重组左臂与右臂，分别在左重组臂的前后 两端加 Sac I和Ase I酶切位点，在右重组臂的前端加了 EcoR V和Afl II酶切位点，后 端加了 Xho I酶切位点。左重组臂（PRELF/PRELR)的长度为1416bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 4所示，右重组臂（PRERF/PRERR)的长度为1543bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所 /_J、1 ο
[0055] 表1扩增同源重组臂的引物
[0056]
【权利要求】
1. 一种伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株是伪狂犬病毒的基因缺失弱毒株，其 缺失的基因序列包括：编码伪狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序列、以及编 码伪狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
2. 根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序 列包括：伪狂犬病毒gl基因第594-1101位碱基的核苷酸序列、以及伪狂犬病毒gE基因第 1-1212位碱基的核苷酸序列。
3. 根据权利要求1所述的伪狂犬病毒弱毒株，其特征在于，所述弱毒株缺失的基因序 列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
4. 一种重组载体，其特征在于，该重组载体包含伪狂犬病毒gl基因和gE基因的部分 序列，其中不包含以下基因序列：编码伪狂犬病毒gl蛋白第198-366位氨基酸的核苷酸序 列、以及编码伪狂犬病毒gE蛋白第1-404位氨基酸的核苷酸序列。
5. -种伪狂犬病毒弱毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 构建权利要求4所述重组载体，该重组载体还包含有EGFP荧光标记基因； (2) 提取伪狂犬病毒总DNA，将该总DNA与步骤（1)的重组载体共转染细胞，获得含 EGFP荧光标记的重组伪狂犬病毒； (3) 构建权利要求4所述重组载体，该重组载体不包含EGFP荧光标记基因； (4) 提取步骤（2)获得的重组伪狂犬病毒的总DNA，将该总DNA与步骤（3)的重组载体 共转染细胞，获得不包含EGFP突光标记的重组伪狂犬病毒，该重组伪狂犬病毒即为伪狂犬
6. -种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的权利要求 1至3中任一项所述的伪狂犬病毒弱毒株。
7. 根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物适于滴鼻、注射。
8. 权利要求1至3中任一项所述的伪狂犬病毒弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫 苗中的应用。
9. 一种区分权利要求1所述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，其特征在 于，包含：针对SEQ ID NO. 1所示缺失基因序列设计的引物对。
10. -种区分权利要求1所述伪狂犬病毒弱毒株与野毒株感染的检测试剂盒，其特征 在于，包含伪狂犬病毒gE蛋白抗体。
【文档编号】C12N7/00GK104152416SQ201410002656
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】童光志, 童武, 郑浩, 刘飞, 梁超, 周艳君, 单同领, 于海, 姜一峰, 高飞 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所