一种梨果实果梗长度主效qtl位点的snp分子标记方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种与梨果实果梗长度主效QTL位点的SNP标记方法及其应用，属于植物分子育种领域。梨果梗长度主效QTL位点的SNP标记为Pyb07_095（LOD值=9.19），位于scaffold278.0的第502462个碱基处。利用Pyb07_095开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实果梗长度的特异标记，该特异引物可对果梗长度进行良好分型，即检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异。本发明提供的梨果实果梗长度主效QTL分子标记可用于梨果实果梗长度性状的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
【专利说明】一种梨果实果梗长度主效QTL位点的SNP分子标记方法及
其应用
[0001]一、【技术领域】
本发明属于分子遗传育种领域，提供了梨果实果梗长度的主效QTL位点及其SNP标记方法，可用于梨果实果梗长度性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
[0002]二、【背景技术】
我国是世界梨属L.)植物最主要的起源地之一，遗传多样性丰富。梨的栽培种分布广泛，除了海南省和台湾省，都有栽培。梨果实的营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。果梗长度是影响梨果实发育和品质的重要因素之一，果柄是水分和碳水化合物运输到果实内的必经之路，其长短与粗细也直接影响到物质的运转。梨低序位果果柄粗且短，有利于营养和水分的运输，因此一般留果都选择留低序位的果。碳水化合物的运输可能因果柄的限制而运输速率降低，导致高序位果果实发育状况较差或滞后，采收时果实较小。果梗长短在梨果实发育中起到重要作用，同时也是梨采后分级的重要标准，果梗的完好通常是水果新鲜度的表征，果梗缺损会导致其内部水分流失，加上其干枯和腐烂，会进一步影响到果实的品质。因此，果梗长度是梨新品种选育时的重要评价指标之一。
[0003]由于绝大多数梨品种是自交不亲和的，梨的遗传组成表现高度杂合性；同时，由于多年生果树的农艺性状多数表现为数量性状遗传特征，有关梨的重要性状遗传规律研究相对滞后，也难以开展目标性状的遗传改良。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座(QTL)定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状表型之间的关系，可直接确定控制数量性状位点，开发可应`用于分子标记辅助选择育种的技术，这已在许多重要农作物上取得了成功应用。
[0004]目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段，已有的研究主要是针对一些病害或生长性状，对梨果梗长度性状的QTL定位及检测QTL位点上的多态性表达果梗长度大小差异的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。因此，开展梨果梗长度性状的QTL定位，基于相应序列信息开发SNP分子标记，并建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果实品质，提高育种效率，节约生产成本显得尤为重要。
[0005]三、
【发明内容】
技术要求
本发明的目的是定位梨果实果梗长度主效QTL，根据贡献位点Pyb07_095序列信息开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实果梗长度的SNP特异标记，检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异。通过该分子标记可以预测梨果梗长度的大小，为实现果梗长度性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。
[0006]技术方案一种与梨果实果实果梗长度主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于:
正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，
反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，
该引物用来检测梨基因组序列scaffold278.0 (登录号为AJSUOOOOOOOO)的第502462个碱基处是否存在一个与梨果实果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095，同时检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异，该SNP位点位于第7连锁群的33.5 cM处，其解释了遗传变异的25.68%，L0D值为9.19。
[0007]所述引物用于检测梨果实果梗长度主效QTL位点的SNP标记方法，其特征在于:HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的
说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪上进行；
10 μ L反应体系:含有2 ng.μ 1梨基因组DNA模板，1 X Master Mix, 2.0 mmol
?I71 MgCl2,0.2 mmol.I71权利要求1所述的引物；
扩增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C预变性10 min，然后95 V变性10s、60~55 V (每循环下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环。扩增产物序列大小在249bp，表明存在一个与梨果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095 ；
PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再从65 ° C连续升温至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集荧光1次，最后降温至40 ° C;
最后，在 Light Cycler? 480 II 的 Gene Scanning 软件中 1.5 version 自动生成扩增产物的熔解曲线，分别以已知梨果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095上表达的果梗长度大的品种和表达的果梗长度小的品种为对照，检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异。如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨梗长度主效QTL位点Pyb07_095上的多态性表达的果梗长度大小和对照相似。
[0008]所述的已知与梨果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095上多态性表达的果梗长度大的品种为‘砀山酥梨’，表达的果梗长度小的品种为‘八月红’。
[0009]所述引物和方法可以用在梨分子育种中检测与梨果实纵径主效QTL位点是否存在，同时检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异。
[0010]有益效果
(1)本发明首次对决定‘八月红’和‘砀山酥梨’果实果梗长度的数量性状位点进行了QTL定位，定位的QTL位点对该数量性状的贡献率较高，位点的贡献率为25.68%。这为实现分子辅助育种多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提。
[0011](2)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需(5cM,本发明中果梗长度主效QTL定位直接定位到SNP标记上，且L0D值为9.19，连锁性和可靠性高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。
[0012](3)本发明根据定位的梨果梗长度性状主效QTL位点连锁标记Pyb07_095开发检测梨果梗长度大小的SNP标记引物，用于预测QTL位点Pyb07_095上多态性表达果梗长度大小差异，为梨果实果梗长度大小的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
[0013](4)利用开发的SNP标记引物，对‘八月红’和‘砀山酥梨’ 29株杂交群体进行QTL位点Pyb07_095上多态性表达果梗长度大小差异基因型检测，可将杂交群体分为两组，与果实实际测量的果梗长度大和小相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对后代果梗长度进行良好分型(图2)，因此，具有良好的应用价值，可实现对梨果实果梗长度性状的预先选择和辅助育种。
[0014]四、【专利附图】
【附图说明】
图1为梨果梗长度主效QTL区间及SNP标记位点Pyb07_095在第7连锁群上的位置。LG7代表的是‘八月红’和‘砀山酥梨’合并遗传连锁图谱的第7连锁群。SNP标记名称起始为‘Pyb’的代表来自‘八月红’的SNP标记，起始名称为‘Pyd’的代表来自‘砀山酥梨’的SNP标记。
[0015]连锁群左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为cM。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间。右边的曲线图为QTL的L0D分布图，灰色线为3.0阈值。果实果梗长度QTL位点对应连锁群上的Pyb07_095标记，其位于7连锁群33.5 cM处，L0D值为9.19。
[0016]图2为依据Pyb07_095开发的HRM特异标记引物，在‘八月红’和‘砀山酥梨’后代29个个体中检测的溶解曲线，可良好分型。熔解曲线:线型1—绿色曲线，16株个体，果梗长度平均值4.28 cm;线型2—蓝色曲线，13株个体，果梗长度平均值3.36cm。两组差值
0.92 cm，差异达到极显著水平，(P小于0.01)。
[0017]五、【具体实施方式】实施例1:
梨果实果梗长度主效QTL连锁的分子标记，是通过以下方法获得的:a)利用‘八月红’和‘砀山酥梨’(品种为公知公用，见文献:张瑞萍等，梨AFLP标记遗传图谱构建及果实相关 性状的QTL定位，园艺学报，2011，38 (10):1991 - 1998)杂交获得其102株？1后代单株。
[0018]b)利用RADseq方法高通量测序，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型，利用X 2测验分析各标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔遗传分离比例。
[0019]c)用Joinmap4.0分析软件构建‘八月红’和‘砀山酥梨’的分子遗传连锁图谱。将第b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适于CP群体构图的格式导入Joinmap4.0，排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点，卡方检测的P值为0.05，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图。
[0020]d)对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其匕群体单株的果实果梗长度进行测定，测定方法采用游标卡尺的方法。
[0021]e)将果梗长度的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL5.0软件，选择区间作图法，以L0D值> 3.0为标准，对梨的果梗长度进行QTL分析和定位。结果表明，在‘八月红’和‘砀山酥梨’的第7连锁群上检测到果梗长度的主效QTL位点(图1)，对该性状的贡献率为25.68%，其对应的SNP标记Pyb07_095在连锁群上的遗传距离为33.5 cM, L0D值为
9.19。
[0022]f)利用SNP标记位点Pyb07_095开发HRM特异引物。
[0023]通过梨全基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn/),搜索出第7连锁群上SNP标记Pyb07_095的DNA序列，选取的该位点前后200 bp的序列，依据引物设计原则，开发设计SNP标记引物。正向引物序列LFP-F为‘5- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3’；反向引物LFP-R为5 GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3’。扩增产物序列大小249bp，利用设计的SNP标记引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。因此，该引物可作为梨果梗长度性状的检测标记。
[0024]g)利用HRM技术对梨果实果梗长度进行分型。
[0025]HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪上进行。
[0026]10 μ L反应体系:含有2 ng.μ L-1梨基因组DNA模板，1 X Master Mix,.2.0 mmol.L—1 MgCl2,0.2 mmol.L—1权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C预变性 10 min,然后 95 °C 变性 10 s、60 ~55 °C (每循环下降.0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环。
[0027]PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95 ° Cl min, 40 ° C I min, 65 ° CI S，再从65 ° C连续升温至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集荧光I次，最后降温至40
° C。
[0028]最后，在LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 软件中 1.5 version 自动生成扩增产物的熔解曲线
利用g)步骤中得到的SNP标记引物对‘八月红’ X ‘砀山酥梨’的29个杂交后代群体进行HRM分析(图2)。
[0029]线型I一绿色曲线， 16个体线型相似，平均值4.28 cm，为果梗长度大；
线型2—蓝色曲线，13个体线型相似，平均值3.36 cm，为果梗长度小。
[0030]统计分析表明，29个个体分型为两种基因型，分离比例为16:13。根据QTL位点Pyb07_095上多态性表达果梗长度大小差异基因分型结果将29个个体的果梗长度表型数据，进行显著性测验，测验结果显示两类基因型的个体果梗长度差值为0.92 cm，差异极显著(P=0.0002)。因此，通过对果梗长度性状的表型测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明该特异SNP标记可检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异，对梨果实果梗长度良好分型。
【权利要求】
1.一种与梨果实果梗长度主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于:正向引物 LFP-F 5，- TTGCACCGTATAGTTTTACAACCTG-3，反向引物 LFP-R 5，- GCAAGAAGGGATAAAAGAGCTAGA-3，该引物用来检测登录号为AJSUOOOOOOOO的梨基因组序列scaffold278.0的第502462个碱基处是否存在一个与梨果实果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095，同时检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异，该位点位于第7连锁群的33.5 cM处，其解释了遗传变异的25.68%，对应的SNP标记为Pyb07_095，LOD值为9.19。
2.权利要求1所述引物用于检测梨果实果梗长度主效QTL位点的SNP标记方法，其特征在于:HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪上进行；10 μ L反应体系:含有2 ng.μ l-1梨基因组DNA模板、1 X Master Mix,2.0 mmol?I71 MgCl2、0.2 mmol.I71权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR:95 °C预变性10 min，然后95 V变性10 s、60~55 °C，每循环下降0.5 °C，退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环；如果扩增产物序列大小在249bp，表明存在 一个与梨果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095 ；PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95 ° C 1 min, 40 ° C 1 min, 65 ° C 1 s，再从65 ° C连续升温至95 ° C，每升高0.04 ° C，收集荧光1次，最后降温至40 ° C;最后，在 LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 软件中 1.5 version 自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果实果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095上表达的果梗长度大的品种和表达的果梗长度小的品种为对照，检测QTL位点Pyb07_095上的多态性表达果梗长度大小的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实果梗长度主效QTL位点Pyb07_095上的多态性表达的果梗长度大小和对照相似。
3.根据权利要求2所述的方法，所述的已知具有与梨果实果梗长度相关的QTL位点Pyb07_095上表达的果梗长度大的品种为‘砀山酥梨’，表达的果梗长度小的品种为‘八月红，。
4.权利要求1所述引物在梨分子育种中的应用。
5.权利要求2或3所述方法在梨分子育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103740828SQ201410014478
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】吴俊 , 张绍铃, 李雷廷, 齐开杰, 刘伦, 谢智华, 陈惠
申请人:南京农业大学