一种梨果实纵径主效qtl位点的snp标记方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种与梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法及其应用，属于植物分子育种领域。与梨果实纵径主效QTL位点紧密连锁的SNP标记为Pyb04_125（LOD值=6.93），位于梨基因组序列scaffold96.0的第329385个碱基处。利用Pyb04_125开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实纵径的特异标记，该特异引物可对果实纵径进行良好分型，即检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异。本发明提供的梨果实纵径主效QTL的SNP标记可用于梨果实纵径性状的分子标记辅助选择育种，对于加快梨品种的遗传改良进程，提高育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。
【专利说明】一种梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法及其应用
[0001]一、【技术领域】
本发明属于分子遗传育种领域，提供了梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法及其应用，可用于梨果实纵径性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率。
[0002]二、【背景技术】
梨(PyrusL.)原产我国，是我国第三大果树树种，因其果实营养价值高，香甜多汁，而深受消费者喜爱。果实大小是梨果综合品质的重要因素之一，纵径作为衡量果实大小的重要指标，直接影响果实的大小，从而影响了梨果实的产量，对于梨的生产应用具有重要的影响。因此，增大梨果实纵径、增加果实大小对改善梨果品质和产量至关重要，是梨育种的重要目标之一。
[0003]由于梨为多年生木本果树作物，与果实品质相关的性状大都是由多基因控制、易受环境影响的数量性状，在分离后代表现为广泛的表型变异，其基因型与表现型间的对应关系难以确定。而以往的传统育种是基于经典数量遗传学理论，把控制某一性状的多个基因作为整体进行研究和选择，在现有基础上改良目标性状难度越来较大。近年来，随着分子标记技术的迅速发展、高密度的分子遗传图谱的出现，以及数量性状作图方法的不断完善，使得数量性状基因座QTL定位变成了现实，也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、准确性及预见性奠定了基础。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系，即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL，通过计算分子标记与QTL之间的交换率，来确定QTL的具体位置。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assisted selection, MAS)育种的技术,这已在许多重要农作物上取得了成功应用。
[0004]目前对梨重要品质性状纵径的Q`TL定位及检测QTL位点上的多态性表达果实纵径大小差异的SNP分子标记研究尚没有`开展。因此，开展梨果实纵径性状主效QTL的定位，基于相应序列信息开发SNP分子标记，并建立杂交后代早期辅助选择技术体系，对于提高梨果实大小和产量等重要性状的遗传改良效率，节约生产成本显得尤为重要。
[0005]三、
【发明内容】
技术要求
本发明的目的是定位梨果实纵径长度的主效QTL，根据贡献位点Pyb04_125序列信息开发基于高分辨率溶解曲线鉴定梨果实纵径的SNP特异标记，检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异。通过检测这些分子标记可以预测梨果实纵径长度的大小，为实现该性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。
[0006]技术方案
一种与梨果实纵径主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物，其特征在于:
正向引物 VD-F 5，- GCATCGAAACCAACACACAA-3 ’
反向引物 VD-R 5，- CTTCTTTCATCCATTAAACACCCA-3，
该引物用来检测梨基因组序列scaffold96.0 (登录号为AJSU00000000)的第329385个碱基处存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125，同时检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，该SNP标记位点位于第4连锁群的42.59 cM处，其解释了遗传变异的22.77%，LOD值为6.93。
[0007]所述引物用于检测与梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法，其特征在于:
HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的
说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪(Roche)上进行；
10yL反应体系:含有2 ng.μ 1梨基因组DNA模板、IX Master Mix,2.0 mmol
?I71 MgCl2、0.2 mmol.I71权利要求1所述的引物；
扩增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C预变性lOmin，然后95 V变性10s、60~55 °C(每循环下降0 .5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环。如果扩增产物序列大小在150bp，则表明存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125 ；PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95°C lmin，40 °C lmin, 65 °Cls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光1次，最后降温至40°C ；
最后，在LightCycler? 480 II的Gene Scanning软件中1.5 version自动生成扩增产物的熔解曲线，分别以已知梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125上表达的果实纵径大的品种和表达的果实纵径小的品种为对照，检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异。如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实纵径主效QTL位点Pyb04_125上的多态性表达的果实纵径大小和对照相似。
[0008]所述的已知与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125上表达的果实纵径大的品种为‘八月红’，或表达的果实纵径小的品种为‘砀山酥梨’。
[0009]所述引物和方法可以用在梨分子育种中检测与梨果实纵径主效QTL位点是否存在，同时检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异。
[0010]有益效果
(1)本发明首次对梨果实纵径的数量性状位点进行了 QTL定位，且定位的QTL位点对该数量性状的贡献率较高，位点的贡献率为22.77%。这为实现基于分子辅助育种的多基因控制性状遗传改良奠定了重要的基础和必要的前提。
[0011](2)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需(5cM,本发明中果实纵径主效QTL定位直接定位到SNP标记上，且L0D值为6.93，连锁性和可靠性高，这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。
[0012](3)本发明根据定位的梨果实纵径性状主效QTL位点连锁标记Pyb04_125开发检测梨果实纵径大小的SNP标记引物，用于检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，预测果实纵径大小差异，为梨果实纵径大小的预先选择提供了可靠的分子标记来源。
[0013](4)利用开发的SNP标记引物，对‘八月红’和‘砀山酥梨’ 57株杂交群体进行基因型检测，可将杂交群体分为两组，与果实实际测量的纵径大和小相符。群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，对后代纵径进行良好分型(图2)，因此，具有良好的应用价值，可实现对梨果实纵径性状的预先选择和辅助育种。
[0014]四、【专利附图】
【附图说明】图1为与梨果实纵径长度的主效QTL区间及SNP标记位点Pyb04_125在第4连锁群上的位置。LG4代表的是‘八月红’和‘砀山酥梨’合并遗传连锁图谱的第4连锁群。SNP标记名称起始为‘Pyb’的代表来自‘八月红’的SNP标记，起始名称为‘Pyd’的代表来自‘砀山酥梨’的SNP标记。
[0015]连锁群上左侧的数字是标记之间的遗传距离，单位为CM。连锁群右侧的实心长方形指示QTL作图区间。右边的曲线图为QTL的LOD分布图，灰色线为3.0阈值。果实纵径QTL位点对应连锁群上的Pyb04_125标记，其位于4连锁群42.59 cM处，LOD值为6.93。
[0016]图2为依据Pyb04_125开发的HRM特异标记引物，在‘八月红’和‘砀山酥梨’ 57株杂交群体中检测的溶解曲线，可良好分型。熔解曲线:线型I一红色曲线，32株个体，为纵径大，均值7.93cm ;线型2—蓝色曲线，25株个体，为纵径小，均值6.24cm。两组差异为1.69cm,达到显著水平，(P小于0.05)。 [0017]五、【具体实施方式】 实施例1:
梨果实纵径主效QTL位点及连锁的分子标记，是通过以下方法获得的:a)利用‘八月红’和‘砀山酥梨’(品种为公知公用，见文献:张瑞萍等，梨AFLP标记遗传图谱构建及果实相关性状的QTL定位，园艺学报，2011，38 (10):1991 - 1998)杂交获得其102个F1后代单株。
[0018]b)利用RADseq方法高通量测序，对‘八月红’和‘砀山酥梨’及后代进行分析，并统计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型，利用X 2测验分析各标记分离是否符合3:1或1:1的孟德尔分离比例。
[0019]c)用Joinmap4.0分析软件构建梨的SNP分子遗传连锁图谱。将b)步骤中得到的符合遗传分离的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适于构图的格式导入Joinmap4.0，排除缺数据过多的位点和显著偏分离的位点，卡方检测的P值为0.05，选择Kosambi作图函数构建遗传连锁图。
[0020]d)对‘八月红’和‘砀山酥梨’及其F1群体单株的果实纵径长度进行测定，采用游标卡尺测量。
[0021]e)将果实纵径长度的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL5.0软件，选择多区间作图法，以LOD值> 3为标准，对梨的纵径长度进行QTL分析和定位。结果表明，在第4连锁群上检测到纵径性状的主效QTL位点，对该性状的贡献率为22.77%，其对应的SNP标记为 Pyb04_125 (图1), LOD 值为 6.93。
[0022]f)利用SNP标记Pyb04_125开发HRM特异引物。
[0023]依据梨全基因组序列(http://peargenome.njau.edu.cn/)搜索到该SNP标记的序列信息，选取其前后200bp的核苷酸序列，依据引物设计原则，应用Primer 5.0设计软件，设计了 I对SNP标记的引物(正向引物序列VD-F为‘5- GCATCGAAACCAACACACAA-3’ ；反向引物VD-R为5 CTTCTTTCATCCATTAAACACCCA-3’)，扩增序列大小为150 bp。利用设计的SNP特异标记引物在‘八月红’和‘砀山酥梨’的基因组DNA上进行PCR扩增，引物均扩增正常，PCR产物符合预测大小。因此，该引物可作为梨果实纵径性状的检测标记。
[0024]g)利用HRM技术对梨果实纵径进行分型。
[0025]HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪(Roche)上进行。
[0026]10 μ L 反应体系中含有 2 ng.μ L-1 DNA 模板，1 X Master Mix, 2.0 mmol.L_1MgCl2,0.2 mmol.I71引物。扩增程序采用降落式PCR (touchdown PCR):95 °C预变性10min，然后95 °C变性10 s、60~55 V (每循环下降0.5 °C)退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环。
[0027]PCR循环结束后进行熔解，其程序为:95 °C lmin, 40°C lmin, 65°Cls，再从65°C连续升温至95°C，每升高0.04°C，收集荧光1次，最后降温至40°C。最后，在LightCycler?480 II的Gene Scanning软件中(1.5 version)自动生成扩增产物的熔解曲线。
[0028]利用g)步骤中得到SNP标记引物对‘八月红’ X ‘砀山酥梨’的57个杂交后代群体进行HRM熔解曲线(图2)。
[0029]线型1 一红色曲线，32株个体线型相似，为纵径大，均值7.93cm ；
线型2—蓝色曲线，25株个体线型相似，为纵径小，均值6.24cm。
[0030]统计分析表明，57个个体分型为两种基因型，分离比例为32:25。根据基因分型结果将这57个个体的果实纵径表型数据，进行显著性测验，测验结果显示两类基因型的个体果实纵径差值为1.69 cm，差异显著(P=0.02)。
[0031]因此，通过对果实纵径性状的表型测定结果与HRM分型结果的比较分析，证明该特异SNP标记可检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，对梨果实纵径良好分型。
【权利要求】
1.一种与梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记引物，其特征在于:正向引物 VD-F 5- GCATCGAAACCAACACACAA-3反向引物 VD-R 5- CTTCTTTCATCCATTAAACACCCA-3 该引物用来检测登录号为AJSUOOOOOOOO的梨基因组序列scaffold96.0的第329385个碱基处存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125，该位点位于第4连锁群的42.59 cM处，其解释了遗传变异的22.77%，对应的SNP标记为Pyb04_125，LOD值为6.93。
2.权利要求1所述引物用于检测与梨果实纵径主效QTL位点的SNP标记方法，其特征在于:HRM 反应体系按照 LightCycler? 480 High Resolution Melting Master 试剂盒中的说明书进行，HRM分析是在LightCycler? 480 II荧光定量PCR仪上进行；10 μ L反应体系:含有2 ng.μ 1梨基因组DNA模板、1 X Master Mix,2.0 mmol?I71 MgCl2、0.2 mmol.I71权利要求1所述的引物；扩增程序采用降落式PCR:95 °C预变性10 min，然后95 V变性10 s、60~55 °C，每循环下降0.5 °C，退火15 s、72 V延伸12 s的程序进行45个循环；如果扩增产物序列大小在150bp，则表明存在一个与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125 ；PCR循环结束后进行熔解，扩增程序为:95°C lmin, 40 V lmin, 65 V ls，再从65°C连续升温至95 V，每升高0.04°C，收集荧光1次，最后降温至40°C ；最后，在 LightCycler? 480 II 的 Gene Scanning 软件中 1.5 version 自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线，分别以已知梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125上表达的果实纵径大的品种和表达的果实纵径小的品种为对照，检测QTL位点Pyb04_125上的多态性表达果实纵径大小的差异，如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、线型相似，则表示在梨果实纵径主效QTL位点Pyb04_125上的多态性表达的果实纵径大小和对照相似。
3.根据权利要求2所述的方法，所述的已知与梨果实纵径相关的QTL位点Pyb04_125上表达的果实纵径大的品种为‘八月红’，表达的果实纵径小的品种为‘砀山酥梨’。
4.权利要求1所述引物在梨分子育种中的应用。
5.权利要求2或3所述方法在梨分子育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK103740829SQ201410014479
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】吴俊 , 张绍铃, 范练, 齐开杰, 李雷廷, 刘伦, 陈惠
申请人:南京农业大学