一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用，属于微生物【技术领域】。本发明获得一株高酸性蛋白酶华根霉（Rhizopus?chinensis），命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC?No.8589。本发明也提供了上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，及所述高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。
【专利说明】一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一株高酸性蛋白酶华根霉及培养方法和应用。
【背景技术】
[0002]酸性蛋白酶有改善白酒风味的作用，该酶可应用于不同工艺、不同香型白酒生产。通过对基础酒各种理化数据进行综合分析及基础酒的感官鉴定，认为酸性蛋白酶适合在酿酒的环境中发挥作用，有改善白酒质量的效果，并能提高原料出酒率。
[0003]酸性蛋白酶能在酸性环境中水解蛋白质，广泛用于制革工业，医药业，酿造业和饲料工业，酸性蛋白酶作为一种新型的饲料添加剂，可以明显促进幼龄动物的生长发育，降低断奶带来的应激效应，饲用效果非常显著，是一类应用前景非常广阔的酶制剂。
【发明内容】
[0004]为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要方法在于提供一株高酸性蛋白酶华根霉。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法。
[0006]本发明的再一目的在于提供上述高酸性蛋白酶华根霉的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一株高酸性蛋白酶华根霉(Rhizopuschinensis)，命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北`辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8589。
[0008]所述的高酸性蛋白酶华根霉从酒曲中分离纯化获得；
[0009]所述的高酸性蛋白酶华根霉为绒毛状，或稠密或疏松，初期呈白色，老化后呈灰黑色；最适生长温度为30°C,最适生长pH为6.5~7.5。
[0010]上述高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，具体步骤为:
[0011]将高酸性蛋白酶华根霉接种于发酵培养基中，培养条件为28~35°C，pH值为
6.5~7.5，培养100~140小时。
[0012]所述发酵培养基的组成:40~80g大米和8~16g黄豆粉，58ml /K，混合煮熟；
[0013]所述发酵培养基的组成具体优选为50g大米和IOg黄豆粉，58ml水，混合煮熟；
[0014]所述的pH值优选为用0.lmol/L的氢氧化钠和0.lmol/L的柠檬酸进行调节；
[0015]所述培养条件，优选为30°C，ρΗ6.8，培养120小时。
[0016]为了使发酵的效果较好，所述高酸性蛋白酶华根霉在接种之前，将斜面菌种活化，培养成液体菌种，液体菌种经过二级种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养。
[0017]所述的斜面菌种是将高酸性蛋白酶华根霉接种于总糖含量为2~20g/L的土豆固体斜面上，在25~35 °C条件下培养30~72小时后，放入4°C冰箱保存。
[0018]所述的斜面菌种活化为将菌种点殖于总糖含量为2~20g/L的土豆平板，28~32 °C平板倒置培养38~42小时；[0019]所述的液体菌种是将保存的高酸性蛋白酶华根霉菌种活化后，接种一环菌丝体于装有100毫升总糖含量为10~50g/L的米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为液体菌种；
[0020]所述的米曲汁液体培养基的成分为:500g大米，加水600ml，蒸煮至熟透，摊凉至室温，加入糖化酶，米饭在糖化酶的作用下，产生的汁液，即为米曲汁，糖度调制20波美度；添加2%琼脂，混合煮沸。
[0021]所述的二级液体种子培养是指:一级液体种子培养，是将液体菌种按体积百分数2~5%的接种量(即培养基体积的2~5%)，接入装有200毫升，总糖含量为10~50g/L的米曲汁的三角瓶中，于25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按体积分数2~5%的接种量(即培养基体积的2~5%)，接入装有100升，总糖含量为10~50g/L的米曲汁的种子培养罐，在25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为二级液体种子培养物。
[0022]本发明使用的发酵培养液是普通的米曲汁，只需要调节其还原糖总含量，即可进行正常生产，方法简单，生产投资较少。
[0023]上述高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。
[0024]一种高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法，具体步骤如下:
[0025]麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40%，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4%的高酸性蛋白酶华根霉，30±1°C培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90~92%，然后湿度调整为85~87%，接着提高箱温为36± 1°C干燥24小时，再提温至38± 1°C干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温高于35°C时，每小时翻曲一次。
`[0026]本发明相比于现有技术的有点和效果为:
[0027]本发明的高酸性蛋白酶华根霉产生的酸性蛋白酶，一方面应用于半固态发酵工艺的白酒生产，既提高了白酒发酵的出酒率，又提高了斋酒中乙酸乙酯、总酯、乙酸、苯乙醇等的含量，使斋酒的酒体更丰满，风味更好；另一方面，应用于豉香型白酒的生产，通过在豉香型的曲种——大酒饼的培养过程中加入以该根霉制作的功能麸曲，使大酒饼的糖化力、发酵力、酸度、蛋白酶、酯化力得到有效的提高，该酒饼应用于豉香型白酒的发酵中使斋酒的总酯、总酸也得到明显的提高，从而使斋酒风味质量更好。
[0028]本发明的方法实用性强，操作简便，易于推广。投资少、见效快、效益高，具有很强的市场竞争力。
【具体实施方式】
[0029]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0030]请提供本发明中高酸性蛋白酶华根霉的来自广东省九江酒厂有限公司的酒曲；分离的步骤方法为:样品经稀释(称取Ig (±0.0005g)酒曲，置于100ml已灭菌的蒸馏水中，充分混和，即得10_2稀释液，用Iml刻度吸管及9ml蒸馏水试管制成10_4、10_5、10_6稀释度)，每个稀释度取Iml于灭菌平皿中，浇灌土豆培养基(土豆培养基的成分为20g去皮土豆，加水煮沸30分钟，用纱布过滤，得到土豆液，定容至100ml，加入2g葡萄糖，2g琼脂，混匀，煮沸)，28— 32°C平板倒置培养38— 42小时，平板画线获得。
[0031]获得高酸性蛋白酶华根霉(Rhizopus chinensis)，命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8589。
[0032]实施例1高酸性蛋白酶华根霉的培养方法
[0033]利用高酸性蛋白酶华根霉发酵生产酸性蛋白酶，步骤如下:
[0034]I)斜面菌种:将菌种接种于含有总糖含量为6g/L的土豆固体斜面上，在28°C条件下培养48小时后，放入4°C冰箱保存；
[0035]2)液体菌种:将保存的高酸性蛋白酶活霉菌斜面菌种活化后，接一环细胞于装有100毫升，总糖含量为12g/L的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于30°C条件下搅拌培养20小时，即为液体菌种；
[0036]3) —级液体种子培养:将液体菌种按体积分数5%的接种量接入装有200毫升，总糖含量为12g/L的大米淀粉糖化液三角瓶中，于30°C条件下搅拌培养18小时，得到一级液体种子培养物；
[0037]4) 二级液体种子培养:将一级种子培养液按体积分数5%的接种量接入装有300升，总糖含量为12g/L的大米淀粉糖化液种子罐，在30°C条件下搅拌培养18小时，得到二级液体种子培养物；
[0038]5)发酵培养基的制备:发酵培养基是总还原糖浓度为100g/L的大米淀粉糖化液，培养基的PH为5.5 ;
[0039]6)发酵罐发酵:将二级种子培养液按体积分数5%的接种量接入装有1000升步骤
5)中配制的总还原糖浓度为100`g/L的大米淀粉糖化液培养基中，在30°C条件下搅拌培养80小时；获得含酸性蛋白酶的发酵液。
[0040]用福林法测定样品中蛋白酶活，测定结果如表1。
[0041]表1样品中蛋白酶活数据比对
[0042]
样品名称 I蛋白酶活(μ/g)^
空白样品 137.86
本发明样品~ 493.45
[0043]空白样品发酵是没有添加本发明样品(高酸性蛋白酶华根霉)的发酵样品，添加本发明样品进行发酵的样品，蛋白酶活明显高于没有添加本发明样品的发酵样品。
[0044]所述的福林法测定蛋白酶活的方法:
[0045]分光光度计:722型分光光度计
[0046]测光密度波长:680nm
[0047]检测样品使用试剂:福林试剂、0.4mol/L碳酸钠溶液、0.4mol/L三氯醋酸溶液、质量分数2%酪蛋白溶液、标准L-酪氨酸溶液、乳酸-乳酸钠缓冲液(pH3.0)。
[0048]绘制标准曲线:
[0049]5%酶浸出液:5g样品(发酵罐发酵获得的发酵液)，用乳酸-乳酸钠缓冲液定容至100ml，在40°C水浴中浸出30min。
[0050]试样测定:lml5%酶浸出液注入离心管，40°C水浴预热5min，加质量分数2%酪蛋白溶液1ml,保温IOminJflA 2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液，中止反应。15min分钟后离心分离。Iml上清液注入试管，加入5ml0.4mol/L碳酸钠溶液和Iml福林试剂，摇匀，在40°C水浴加热20min显色。
[0051]空白试验:与试样测定同时进行(直接加入2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液，样品没有进行反应，2ml0.4mol/L三氯醋酸溶液有中止反应的作用)，离心管中先后注入质量分数5%酶浸出液1ml，0.4mol/L三氯醋酸2ml，质量分数2%酪蛋白溶液1ml。15min分钟后离心分离，以下的操作均与试样测定相同。
[0052]比色测定光密度:以空白试液为对照，在680nm波长下测试样的光密度。
[0053]实施例2高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法:
[0054]麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40%，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4%的高酸性蛋白酶华根霉，30土 1°C培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90~92%，培养第二阶段，湿度降低为85~87%，接着提高箱温为36±1°C干燥24小时，再提温至38±1°C干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温高于35°C时，每小时翻曲一次。
[0055]实施例3
[0056]实施例2制备的高酸性蛋白酶华根霉麸曲在粤宴基酒生产中的应用。
[0057]( I)试验方案所用物质见表2.[0058]表2样品中所加物质成分
[0059]
【权利要求】
1.一株高酸性蛋白酶华根霉(Rhizopus chinensis),其特征在于该高酸性蛋白酶华根霉命名为华，于2013年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)Jia北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCCN0.8589。
2.根据权利要求1所述的高酸性蛋白酶华根霉，其特征在于:所述的高酸性蛋白酶华根霉为绒毛状，稠密或疏松，初期呈白色，老化后呈灰黑色；生长温度为30°C，生长pH为6.5 ~7.5o
3.权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于具体步骤为:将高酸性蛋白酶华根霉接种于发酵培养基中，培养条件为28~35°C，pH值为6.5~7.5，培养100~140小时。
4.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于:所述发酵培养基的组成:40~80g大米和8~16g黄豆粉,58ml水,混合煮熟。
5.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于:所述发酵培养基的组成为:50g大米和IOg黄豆粉,58ml水,混合煮熟。
6.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于:所述的pH值为用0.lmol/L的氢氧化钠和0.lmol/L的柠檬酸进行调节； 所述培养条件为30°C，pH6.8，培养120小时。
7.根据权利要求3所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于:所述高酸性蛋白酶华根霉在接种之前，将斜面菌种活化，培养成液体菌种，液体菌种经过二级种子培养后，接种到发酵培养基中进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的高酸性蛋白酶华根霉的培养方法，其特征在于:所述的斜面菌种是将高酸性蛋白酶华根霉接种于总糖含量为2~20g/L的土豆固体斜面上，在25~35 °C条件下培养30~72小时后，放入4°C冰箱保存； 所述的斜面菌种活化为将菌种点殖于总糖含量为2~20g/L的土豆平板，28~32°C平板倒置培养38~42小时； 所述的液体菌种是将保存的高酸性蛋白酶华根霉菌种活化后，接种一环菌丝体于装有100毫升总糖含量为10~50g/L的米曲汁液体培养基的三角瓶中，于25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为液体菌种； 所述的米曲汁液体培养基的成分为:500g大米，加水600ml，蒸煮至熟透，摊凉至室温，加入糖化酶，米饭在糖化酶的作用下，产生米曲汁，糖度调制20波美度；添加2%琼脂，混合煮沸； 所述的二级液体种子培养是指:一级液体种子培养，是将液体菌种按体积百分数2~5%的接种量，接入装有200毫升，总糖含量为10~50g/L的米曲汁的三角瓶中，于25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按体积分数2~5%的接种量，接入装有100升，总糖含量为10~50g/L的米曲汁的种子培养罐，在25~35°C条件下搅拌培养16~22小时，即为二级液体种子培养物。
9.权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉用于制备麸曲在酿酒中的应用。
10.一种权利要求1或2所述的高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲的方法，其特征在于具体步骤如下:麸皮蒸煮30分钟，培养水分为40%，冷却后拌曲，接种质量分数为0.4%的高酸性蛋白酶华根霉，30±1°C培养2天，入箱至培养18小时培养湿度为90~92%，然后湿度调整为85~87%，接着提高箱温为36± 1°C干燥24小时， 再提温至38± 1°C干燥24小时，获得高酸性蛋白酶华根霉制作麸曲；培养期间温高于35°C时，每小时翻曲一次。
【文档编号】C12N1/14GK103805520SQ201410014845
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】余剑霞, 吴雪梅, 刘幼强, 唐家林 申请人:广东省九江酒厂有限公司