一种ToRCH检测的荧光标记基因芯片试剂制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种能同时用于ToRCH,亦即弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(Rubella?Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo?Virus)、单纯疱疹病毒I/II型(Herpes?Virus)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法。与现有技术相比，本方法具有高特异性，高灵敏度，操作时间短的特点，因此应用前景广阔。此外，本发明还提供采用上述制备方法所得的试剂，以及用于上述检测方法的试剂盒。
【专利说明】一种Torch检测的荧光标记基因芯片试剂制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医学检验和生物芯片【技术领域】，具体来说是提供了一种基因芯片试剂盒对人类泌尿生殖道五种危害较大的病原微生物:ToRCH,即弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯抱疫病毒 I 和 II 型(HerpesVirus I/II)感染进行同时检测。
【背景技术】
[0002]ToRCH是一组病原微生物的英文名称缩写，其中T (Toxopasma)为弓形虫，R(RubellaVirus)为风疫病毒，C (Cytomegalo Virus)为巨细胞，H (Herpes Virus)为单纯疱疹I和/或II型。弓形虫感染会引起的胎儿畸形包括脑积水、小脑畸形、脉络膜视网膜炎及脑钙化，风疹病毒感染引起胎儿先天性白内障、先天性心脏病和神经性耳聋，巨细胞病毒感染引起胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，单纯疱疹病毒I/II型感染引起流产或新生儿发病。
[0003]目前临床上ToRCH检测主要是基于免疫学方法，如用ELISA或胶体金检测相应病原体感染人体后产生的IgG或IgM，检出特异性IgM说明患者为近期感染，或潜伏的病毒被激活产生复发感染，检出特异性IgG则为既往感染，已有一定的免疫水平。用免疫学方法对孕妇外周血中的病原体特异抗原或抗体水平进行检测，其灵敏度和特异性上均存在不足，并且由于使用试剂复杂，操作时间长，不利于患者及时得知检测结果；并且针对能导致胎儿畸形的病原体感染，如ToRCH等，无法做到同时检测。
[0004]生物芯片技术是九十年代发展起来的一项新兴生物技术。按照检测对象来分类，可以分为基因芯片和蛋白质`芯片等两大类。基因芯片指的是将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的之一是提供一种用于同时进行ToRCH,亦即弓形虫(Toxopasma)、风疫病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(CytomegaloVirus)、单纯疱疹病毒I和II型(Herpes Virus I/II)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法，采用该方法制得检测试剂盒以孕妇的外周血、生殖道分泌物、脑脊液等为检测样本，一次检测即可对样本中存在的ToRCH感染做出判断，研究成果可提高临床诊断准确率和时效性，对优生优育具有极其重要的意义。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种能同时检测ToRCH,亦即弓形虫(Toxopasma)、风疫病毒(RubellaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Viuus)、单纯疱疫病毒I / II型(Herpes Virus)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法，该方法包括以下步骤:[0008]1.靶序列确定:
[0009]本发明使用下列靶序列:根据报道的弓形虫(Toxopasma)、风疹病毒(RubellaVirus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯抱疫病毒 I 和 II 型(Herpes VirusI/II)的基因序列，选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列做为检测的靶序列；
[0010]所选取的靶序列经过同源性比对检索后，认为是一段特异性较高的序列；
[0011]弓形虫
[0012]CTATGGTCATGAACCTCAGCGCTTCTGGGAATTCGTTAAAGACATTCCGGAGAAGCTTTCGCAGCCCTCGCCAGTTCTGGAGCTCACTAGGACGCATGCAGGGCAGCCTGACAAGAACGGCGTGTITTTCCTTGGGTCTAGAACGGTAACAAACGAGTGGAAAAAATCTTCCTCGTGGACCCACATTCTTGTGGGACACATG
[0013]风疹
[0014]CTGGCACCGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTTCCCCCCCACACCACCGAGCGCATTGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCCCCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCACGGTCGCCGTTGGCACCGCGCGCGCCGGGCTCCAGCCCCGCGCTGATATGGCGGCACCTC
[0015]巨细胞病毒
[0016]CACGGTTACCACCAACTGTCTCGTGAAAGCAGAAAATACCCACCTGACATGTAAGTGCAATCCGAATACCACATCTAATACCAACAATGGCAGCAAGTGCCACGCGATGTGCAAATGCAGGGTCACAGAACCCATTACCATGCTAGGCGCATACTCGGCCTGGGGCGCGGGCTCGTTCGTGGCCACGCTGATAGTCCTGCTGGTG
[0017]单纯疱疹病毒I型`
[0018]GCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCAG
[0019]单纯疱疹病毒II型
[0020]GTCTAGGGTTGAACCGGCGAGGGCGGCCTCGGCCGGCGGAGCCCCGGAGCTCCGAAGGTCTGCGCGAGGCCGCTCTCCGAAGAGACGATGGGAGCCCCGCGTATATATCCGCGAGGGCCC
[0021]优选地，本发明引入人肌动蛋白β-action基因作为管家基因，对检验过程进行质控。在一次检测结果中，如果肌动蛋白β-action基因检测位点，也即质控位点结果呈阴性，那么这次检测结果是不可靠的，只有待检位点和质控位点同时呈现阳性，该次检测结果才能确认为阳性。
[0022]特异的β -action基因序列作为检验的靶序列，如下:
[0023]TACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGGTATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGC, TTCACcACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAGCTG
[0024]2.探针与引物设计
[0025]靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计的各病原体引物与探针具体序列如下:
[0026]弓形虫TOX
[0027]引物1: 5，cy3— CTATGGTCATGAACCTCAGCGCT— 3 ’
[0028]引物2:5’ 一CATGTGTCCCACAAGAATGTGG— 3，
[0029]5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTAGGGCTGCGAAAGCTTCTCCGGAATGTC—3’
[0030]风疹RV[0031]引物1:5’ cy3—CTGGCACCGACTGCTGCGCATG—3，
[0032]引物2:5 ’ — GAGGTGCCGCCATATCAGCGCG— 3 ’
[0033]5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTAGCGGGTCTCAATGCGCTCGGTGGTGT— 3’
[0034]巨细胞病毒HCMV
[0035]引物1:5，cy3—CACGGTTACCACCAACTGTCTC—3，
[0036]引物2:5，一CACCAGCAGGACTATCAGCGTG—3，
[0037]5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTCACTTACATGTCAGGTGGGTATTTTC— 3’
[0038]单纯疱疹病毒HSV I型
[0039]引物1: 5，cy3GCGAACTCGGTCTAACGTTACAC— 3 ’
[0040]引物2: 5，一CTGGCTCCAAGCGTATATATGCG— 3 ’
[0041 ] 5’ NH3—TTTTTTTTTTTTTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCC— 3 ’
[0042]单纯疱疹病毒HSV II型
[0043]引物1: 5’ cy3GTCTAGGGTTGAACCGGCGAGG— 3 ’
[0044]引物2: 5，— `GGGCCCTCGCGGATATATACGC— 3 ’
[0045]探针:5，NH3— TTTTTTTTTTTTTGGAGCTCCGGGGCTCCGCCGGCCGAG— 3，
[0046]3.引物标记:
[0047]为使PCR结果能及时、有效得到分析，在所有引物I的5’端用花菁素cy3进行标记，cy3的吸收和发射波长分别为548nm、562nm ；
[0048]4.探针修饰
[0049]本发明使用的探针需要经过修饰:探针的5端经过氨基修饰后固定到醛基活化的基因芯片片基上；
[0050]5.待测样本模板提取:
[0051]常规方法及试验步骤提取病原体的基因组；
[0052]6.PCR扩增及荧光标记，
[0053]用RT-PCR技术扩增模板，采用25ul体系，反应条件为95°C，30s ；55°C,45s ；72°C,60min，共35个循环；
[0054]
I使用体积
引物(cy3 标记 5，端)IOpM0.2ul
IOXPCR buffer2.5ul
模板DNA1^1
DNA聚合酶0.5ul
反转录酶0.5ul
dNTP2ul
【权利要求】
1.一种能同时用于ToRCH,亦即弓形虫(Toxopasma)、风疫病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疫病毒I / II型(Herpes Virus)等五种病原体检测的荧光标记基因芯片试剂的制备方法，该方法包括以下步骤: a)靶序列确定: 选择已见报道的弓形虫(Toxopasma)、风疫病毒(Rubella Virus)、巨细胞病毒(Cytomegalo Virus)、单纯疱疫病毒I / II型(Herpes Virus)的基因序列中一段特异性较好、片段长度适合的基因序列做为检测的靶序列；所选取的靶序列经过同源性比对检索后，认为是特异性较高的序列，具体如下: 弓形虫
CTATGGTCATGAACCTCAGCGCTTCTGGGAATTCGTTAAAGACATTCCGGAGAAGCTTTCGCAGCCCTCGCCAGTTCTGGAGCTCACTAGGACGCATGCAGGGCAGCCTGACAAGAACGGCGTGTTTTTCCTTGGGTCTAGAACGGTAACAAACGAGTGGAAAAAATCTTCCTCGTGGACCCACATTCTTGTGGGACACATG(SEQ.1D.N0.1) 风疹
CTGGCACCGACTGCTGCGCATGCCAGTGCGCGGCCTCGACGGCGACAGCGCCCCGCTTCCCCCCCACACCACCGAGCGCATTGAGACCCGCTCGGCGCGCCATCCTTGGCGCATCCGCTTCGGTGCCCCCCAGGCCTTCCTTGCCGGGCTCTTGCTCGCCACGGTCGCCGTTGGCACCGCGCGCGCCGGGCTCCAGCCCCGCGCTGATATGGCGGCACCTC(SEQ.1D.N0.2) 巨细胞病毒
CACGGTTACCACCAACTGTCTCGTGAAAGCAGAAAATACCCACCTGACATGTAAGTGCAATCCGAATACCACATCTAATACCAACAATGGCAGCAAGTGCCACGCGATGTGCAAATGCAGGGTCACAGAACCCATTACCATGCTAGGCGCATACTCGGCCTGGGGCGCGGGCTCGTTCGTGGCCACGCTGATAGTCCTGCTGGTG(SEQ.1D.N0.3) 单纯疱疹病毒I型
GCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCAG(SEQ.1D.N0.4) 单纯疱疹病毒II型
GTCTAGGGTTGAACCGGCGAGGGCGGCCTCGGCCGGCGGAGCCCCGGAGCTCCGAAGGTCTGCGCGAGGCCGCTCTCCGAAGAGACGATGGGAGCCCCGCGTATATATCCGCGAGGGCCC(SEQ.1D.N0.5) b)探针与引物设计 设计的各病原体引物与探针具体序列如下: 弓形虫TOX
引物 1:5’ cy3—CTATGGTCATGAACCTCAGCGCT—3，(SEQ.1D.N0.7)
引物 2:5’ 一CATGTGTCCCACAAGAATGTGG— 3’ (SEQ.1D.N0.8)
探针:5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTAGGGCTGCGAAAGCTTCTCCGGAATGTC— 3’ (SEQ.1D.N0.17)
风疹RV
引物 1:5’ cy3—CTGGCACCGACTGCTGCGCATG—3，(SEQ.1D.N0.9)
引物 2:5’ 一GAGGTGCCGCCATATCAGCGCG— 3，(SEQ.1D.N0.10)
探针:5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTAGCGGGTCTCAATGCGCTCGGTGGTGT— 3’ (SEQ.1D.N0.18)
巨细胞病毒HCMV 引物 1:5’ cy3—CACGGTTACCACCAACTGTCTC—3，(SEQ.1D.N0.11)引物 2:5’ 一CACCAGCAGGACTATCAGCGTG—3’ (SEQ.1D.N0.12)
探针:5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTCACTTACATGTCAGGTGGGTATTTTC— 3’ (SEQ.1D.N0.19) 单纯疱疹病毒HSV I型
引物 1:5’ cy3 — GCGAACTCGGTCTAACGTTACAC— 3’ (SEQ.1D.N0.13)
引物 2:5’ 一CTGGCTCCAAGCGTATATATGCG— 3’ (SEQ.1D.N0.14)
探针:5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCC— 3’ (SEQ.1D.N0.20) 单纯疱疹病毒HSV II型
引物 1:5’ cy3—GTCIAGGGTTGAACCGGCGAGG—3，(SEQ.1D.N0.15)
引物 2:5’ 一GGGCCCTCGCGGATATATACGC— 3’ (SEQ.1D.N0.16)
探针:5，NH3 — TTTTTTTTTTTTTGGAGCTCCGGGGCTCCGCCGGCCGAG— 3，(SEQ.1D.N0.21) c)引物标记: 在所有引物I的5’端用花菁素cy3进行标记，cy3的吸收和发射波长分别为548nm、562nm ； d)探针修饰 探针的5端经过氨基修饰后固定到醛基活化的基因芯片片基上； e)待测样本模板提取: 用常规方法及试验步骤提取待测样本病原体的基因组； f)PCR扩增及荧光标记， 用RT-PCR技术扩增模板，采用25ul体系，反应条件为95°C，30s ；55 °C,45s ；72°C,60min,共35个循环
2.根据权利要求1所述的能同时检测ToRCH的荧光标记基因芯片试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤a)的靶序列确定中引入人肌动蛋白β-action基因作为管家基因，对检验过程进行质控点监测，特异的β-action基因序列作为检验的靶序列，如下:
TACCACTGGCATCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGGTATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAGCTG(SEQ.1D.N0.6)。
3.根据权利要求1所述ToRCH检测荧光标记基因芯片试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤i)的结果分析，具体如下:质控位点与待测样品皆为阳性:检出； 质控位点阳性，待测样品为阴性:未检出； 质控位点阴性，待测样品阴性:试验过程有误，需重检。
4.根据权利要求1~5中任一项所述制备方法制得的试剂在ToRCH检测荧光标记基因芯片试剂盒中的应用。
5.一种ToRCH检测荧光标记基因芯片试剂盒，其特征在于，包含下列探针: 弓形虫TOX探针:
5’NH3—TTTTTTTTTTTTTAGGGCTGCGAAAGCTTCTCCGGAATGTC—3’ (SEQ.1D.N0.17) 风疹RV探针:
5’NH3—TTTTTTTTTTTTTAGCGGGTCTCAATGCGCTCGGTGGTGT—3’ (SEQ.1D.N0.18) 巨细胞病毒HCMV探针:
5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTCACTTACATGTCAGGTGGGTATTTTC— 3’ (SEQ.1D.N0.19) 单纯疱疹病毒HSV I型探针:
探针:5’ NH3 — TTTTTTTTTTTTTCCCGGGAGCTCCGCGGAAGACCCAGGCC— 3’ (SEQ.1D.N0.20)
单纯疱疹病毒HSV II型探针:
5’ NH3 — TTTTTTTTTT TTTGGAGCTCCGGGGCTCCGCCGGCCGAG— 3’ (SEQ, ID, NQ.21)。
【文档编号】C12Q1/70GK103805715SQ201410016220
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】范晓军, 赵秋勇, 李瑶, 刘建红 申请人:太原理工大学