丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子及活性分析的制作方法
【专利摘要】丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子及活性分析属生物工程【技术领域】，本发明提供了一种获得的丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列，所述启动子序列如SEQIDNO:1所示，其中SEQID?NO：1的-1bp至-393bp区为丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子DNA序列，SEQIDNO:1的+1bp至+268bp区为玉米螟蚜P450基因OfCYP的5’非翻译区的DNA序列；本发明可用于真核基因的高效表达，应用于获得低丰度基因研究，使其获得高水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。
【专利说明】丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子及活性分析
【技术领域】
[0001]本发明属生物工程【技术领域】，涉及一段DNA序列，它可以作为启动子调控基因的表达。具体涉及一种来源于玉米螟P450基因(GenebankN0.EU807990)并在细胞中高度表达的诱导型启动子序列。
【背景技术】
[0002]玉米螟是一种重要的世界性农业害虫，通过米心叶期幼虫取食叶肉或蛀食未展开的心叶，造成“花叶”，抽穗后钻蛀茎杆，致雌穗发育受阻而减产，蛀孔处易倒折。穗期蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺损霉烂，品质下降。玉米在生长发育过程中产生许多次生物质，其中有些对害虫有明显的防御功能，影晌害虫的行为、生长发育和生殖。丁布为氧肟酸类中最重要的一种，在我国有人称之为玉米植抗素，它能抑制欧洲玉米螟幼虫的生长，增加幼虫死亡率，使得幼虫期和蛹期延长，导致蛹重下降，成虫繁殖力降低。丁布导致近似消化能力降低和摄取食物转化率降低。已有研究结果表明，丁布可以诱导玉米螟细胞色素P450基因OfCYPCgene bankN0.EU807990)高表达。这可能是玉米螟利用丁布作为化学感应信号来启动其防御机制进而应对丁布胁迫的重要生理机能。同时这也显示出玉米螟OfCYP基因启动子极可能具有较高诱导活性，迄今为止，未有从玉米螟中分离的诱导型高活性启动子。目前能应用于真核表达研究的丁布诱导型玉米螟启动子还未有。因此，对于新的高活性的丁布诱导型玉米螟相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用，以及与这些元件互作的转录因子的研究具有重要意义，对深入研究害虫植物次生物质耐受性机制及新型抗虫新品种的研制奠定基础。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是提供一种丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米螟P450基因OfCYP。
[0004]本发明的第二个目的是提供一种用于真核细胞转染的玉米螟OfCYP启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因OfCYP的启动子序列和5’非翻译区。
[0005]本发明的第三个目的是提供一种所述真核细胞表达载体的表达，该载体的表达能反映启动子活性的高低。
[0006]为实现上述目的，本发明克隆了玉米螟P450基因OfCYP的启动子区，并构建了真核表达载体，所述载体包含带有OfCYP基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在Sf9细胞中表达，并检测到该启动子的高水平活性。
[0007]本发明提供一种获得的丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列，所述启动子序列如SEQID NO:1所示，其中SEQIDN0:1的-1bp至_393bp区(见序列表)为丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子DNA序列，在真核细胞中本发明所述的启动子高水平活性。
[0008]获得的丁布诱导型OfCYP启动子序列源自玉米螟P450基因OfCYP。
[0009]SEQIDN0:1的+Ibp至+268bp区(见序列表)为玉米螟蚜P450基因OfCYP的5’非翻译区的DNA序列，本发明所述的玉米螟OfCYP基因的5’非翻译区能在Sf9细胞中通过增强目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。
[0010]为实现另一个目的，本发明提供一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体包含丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列。
[0011]上述用于Sf9细胞转染的真核表达载体是指能够在细胞中瞬时、高水平表达外源基因的载体。例如PGL3载体、PGL4载体。
[0012]一种用真核细胞表达载体的表达，所述真核细胞表达包含丁布诱导型玉米螟OfCYP启动子序列。
[0013]关于本发明所述的用于真核细胞的表达载体(pGL3)，所述的玉米螟OfCYP基因的启动子和5’非翻译区在表达载体中位于外源基因(Luc+)的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米螟OfCYP基因的启动子和5’非翻译区至含有Luc+报告基因的载体中而构建的pGL3-0fCYP (-393/+268)。但是，所述Luc+报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。
[0014]本发明提供来自玉米螟OfCYP基因的启动子和5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在真核细胞中进行高水平的表达。
[0015]本发明的有益效果在于:可用于真核基因的高效表达，应用于获得低丰度基因研究，使其获得闻水平、稳定表达，对于目的功能研究具有积极意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为桃蚜基因组电泳图
[0017]图2 为 GenomewalkerPCR 电泳图
[0018]图3为OfCYP连T载酶切鉴定电泳图
[0019]图4为OfCYP连pGL3PCR鉴定电泳图
[0020]图5为OfCYP连pGL3酶切鉴定电泳图
[0021]图6为pGL3-0fCYP (-393/+268)转染Sf9细胞后启动子活性检测示意图 图7为pGL3-0fCYP (-393/+268)表达载体示意图
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的【具体实施方式】来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。 [0023]实施例1:玉米螟OfCYP启动子的克隆
[0024]依据玉米螟P450基因OfCYP的mRNA序列(GenbankN0.EU807990)设计染色体步移引物 GSPl (5-CGACAAATGTCCTGTGAGACTTCTCCTAC-3)和 GSP2 (5-CTTTTTCTTCCAGTAGTTGTGGTTTTTCG-3) ο 提取玉米螟基因组 DNA (图 1)，并用平切酶 Afe1、EcoRV-HF、PvuI1、Sma1、Pme1、StuI进行消化，纯化DNA并连接接头引物。按照设计的特异性引物进行PCR扩增，并按照Genomewalker (Clontech) PCR方法进行扩增。扩增得到目的片段，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出长度为661bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与pGEM-T载体连接得到重组质粒，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。[0025]玉米螟OfCYP启动子(启动子序列包含相对于SEQIDN0:1的转录起始位点的-1bp至-393bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米螟OfCYP基因的5’区序列中得到鉴定。
[0026]在本文件的启动子序列表中,转录起始位点的碱基用+1示出,ATG用红色标注。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。
[0027]启动子分析网站 http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index, html
[0028]实施例2:玉米螟OfCYP启动子表达载体pGL3-0fCYP (-393/+268)的构建
[0029]将在实施例1中所克隆的玉米螟OfCYP启动子和5’非翻译区(见序列表)插入到PGL3载体中，从而构建pGL3-0fCYP (-393/+268)载体。
[0030]更具体地说，利用引物(5-ACGCGTGTGAAGCCCAGTAAAAGCT-3，5-CTCGAGCTTTTTCTTCCAGTAGTTGTG-3)扩增并将该启动子序列克隆到pGL3载体MluI和XhoI位点上，构建成pGL3-0fCYP (-393/+268),用于驱动Luc+的表达，经PCR鉴定(图4)和酶切鉴定(图
5)获得启动子与载体的重组质粒。
[0031]实施例3:鉴定本发明所述的玉米螟OfCYP启动子的活性
[0032]Sf9 细胞接种于 24 孔板中(4X IO5Cells/ 孔)，用 CellfectinII 试剂(Invitrogen ；2 μ L/ 每孔)瞬时共转染 pGL3_0fCYP (-393/+268)建体(2 μ g/ 孔)和对照报告基因质粒phRL-TK (Promega; 0.2 μ g/孔)，。48小时后，收获细胞，将所得裂解物用于测量萤光素酶活性(Promega)。如图6所示，pGL3_0fCYP(-393/+268)所转染细胞具有很高荧光素酶活性。
[0033]实用性
[0034]如上所述，本发明提供玉米螟OfCYP基因启动子和5’非翻译区。
[0035]本发明提供分别将玉米螟OfCYP基因启动子和5’非翻译区插入至pGL3而获得的真核细胞表达载体。
[0036]经使用所述的真核细胞表达载体进行鉴定，本发明所述的玉米螟OfCYP基因启动子和5’非翻译区能够启动下游基因的表达。因此，本发明可用于提高真核基因的高效表达，应用于获得低丰度基因研究使其获得闻水平、稳定表达。
[0037]
【权利要求】
1.一种获得的丁布诱导型玉米螟0%奸启动子序列，其特征在于所述启动子序列如SEQ IDNO:1所示，其中3即10勵:1的-1恥至-3931^区为丁布诱导型玉米螟0代^？启动子DNA序列，3即10勵:1的+11^至+268?)区为玉米螟蚜？450基因0？?^？的5’非翻译区的DNA序列。
2.一种用于细胞系转染的真核细胞表达载体，其特征在于所述真核细胞表达载体包含权利要求1所述的丁布诱导型玉米螟0%奸启动子序列。
3.一种用真核细胞表达载体的表达，其特征在于所述真核细胞表达包含权利要求1所述的丁布诱导型玉米螟OFCYP启动子序列。
【文档编号】C12N15/113GK103834659SQ201410020531
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】尚庆利, 潘怡欧, 杨晨, 席景会, 杨巽, 毕锐 申请人:吉林大学