鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法

文档序号:468614阅读:230来源:国知局
鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法
【专利摘要】本发明主要涉及一种鉴定多年生黑麦草种子真伪特异分子标记专用引物。具体涉及多年生黑麦草和多花黑麦草种子特异分子标记引物试剂盒及其鉴定方法。一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物试剂盒,其主要特点是包括有:多年生黑麦草PCR检测体系的总体积为20μl,其中包括2×PCR?Master,引物Lolium-F:TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,引物Lolium-R:CTTTGATCCGCATATGTTTGG和ddH2O。本发明的优点是具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点,在我国黑麦草产业化推广中具有广阔的应用前景,可确保黑麦草更好地为畜牧业生产服务,为保障我国的牧草安全生产奠定坚实的基础。
【专利说明】鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001]本发明主要涉及一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记及其专用引物。具体涉及多年生黑麦草的特异分子标记及其鉴定方法。
【背景技术】
[0002]多年生黑麦草(Lolium perenne)具有生长快,分蘖多,繁殖能力强,是世界温带地区最重要的优良牧草之一,越冬越夏能力较高(2002,于应文)。多花黑麦草(L.multiflorum)属于一年生牧草,具有生长快速,产草量高,饲用品质优,适牧性好。可作为高寒牧区建植一年生刈牧兼用型人工草地的优良草种(2004,张卫国),但其生育周期只有一年。而这两种牧草的种子、幼苗、叶片和干草在外观形态上极其相似(图1),分辨十分困难,极易造成不可挽回的损失,而现在国内外还没有一个统一的、行之有效的鉴定方法。
[0003]因而准确迅速区分多年生黑麦草和多花黑麦草种子,对于提高我国黑麦草种子的利用具有十分重要的意义。
[0004]准确迅速区分多年生黑麦草和多花黑麦草种子是鉴别黑麦草种子中的一大难题。前人对两种牧草种子的鉴定技术进行了很多尝试性的研究,并取得了一定的成就,可将这些方法归纳为二类:一是根据种子气味、形态和色泽等形态学特征进行区分。但是由于两个草种的种子外形和颜色十分相似,不易区分,特别是在成熟度不一致以及环境、气候等因素的影响而造成种子形态不规则的情况下,鉴定工作的难度则更大,鉴定结果具有一定的主观性;二是田间鉴定,这种方法是将种子播种于试验田,待出苗后每隔7~IOd观察一次,最后鉴定出多年生黑麦草和多花黑麦草。此种方法最终能鉴定出多年生黑麦草和多花黑麦草,但是由于这两种牧草分别是多年生和一年生植物,苗期差异不明显,所以该方法具有成本高、周期长和效率低等不足`,极易造成大量经济损失。

【发明内容】

[0005]本发明的目的一是避免现有检测技术的不足,提出一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物。
[0006]本发明的目的二是提供一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒。
[0007]本发明的目的三是提供一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法。
[0008]以便快速、高效和准确的鉴定多年生黑麦草种子的真伪。此方法省时省力,操作简便,在实验室条件下较短时间内能够很好的完成。研究中,随机选取的10个黑麦草种质都可适用,具有很强的推广价值,有助于种子检验人员对多年生黑麦草种子和多花黑麦草种子的区分,使黑麦草更好的为畜牧业生产服务,为保障我国的粮食安全打下坚实的基础。
[0009]为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物,其主要特点是包括有:
[0010]黑麦草专用引物:Lolium-F(5' -3' ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,[0011]Lolium-R (5' -3/ ):CTTTGATCCGCATATGTTTGG。
[0012]一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,其主要特点是包括有:
[0013]多年生黑麦草PCR检测体系的总体积为,其中包括2XPCR Master (20mMMgCl2,2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq 和 2XPCR Buffer),弓丨物 Lolium-F (5 'TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,引物 Lolium-R (5' -3/ ):CTTTGATCCGCATATGTTTGG, ddH20 ;
[0014]一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法,其主要特点是包括如下步骤:
[0015]A.采集种子,采用双层滤纸萌发法,20~30°C萌发72h,提取萌发种子基因组DNA备用;
[0016]B.利用黑麦草专用引物,对多年生黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系总体积为 20 μ I,其中包括 2 X PCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq和 2XPCR Buffer) 10μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/y 1,1μ 1,引物 Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 μ I ;
[0017]扩增条件为:(1)94°C预变性3min ; (2)94°C变性 35s ; (3)54°C退火 35s ; (4)72。。延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次; (6) 72°C延伸7min ;
[0018]C.利用黑麦草专用引物,对多花黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为 20μ 1,其中包括 2XPCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq和 2XPCR Buffer) 10μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/y 1,1μ 1,引物 Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 μ I ;
[0019]扩增条件为:(1)94°C预变性3min ; (2)94°C变性 35s ; (3)54°C退火 35s ; (4)72。。延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次;(6) 72°C延伸7min。
[0020]D.PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测;
[0021]E.其电泳扩增条带多年生黑麦草176bp,多花黑麦草156bp。
[0022]本发明的有益效果是,可以有效的鉴定出多年生黑麦草和多花黑麦草种子。此方法具有灵敏性强、准确率高、重复性强和快速便捷等特点,能够进行大批量黑麦草种子的检测,为保障准确区分黑麦草种子提供可行依据。
【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1.多年生黑麦草和多花黑麦草在形态学上的相似性;
[0024]图中:A、B为多年生黑麦草和多花黑麦草种子;C、D为多年生黑麦草和多花黑麦草单株;E、F为多年生黑麦草和多花黑麦草幼苗,G、H为多年生黑麦草和多花黑麦草叶片对照图(注:图中比例尺表示Icm);
[0025]图2.多年生黑麦草和多花黑麦草各15份单株的PCR鉴定结果。图中:1_15号分别是多年生黑麦草和多花黑麦草的单株;
[0026]图3.多年生黑麦草和多花黑麦草各10个种质的PCR鉴定结果。图中:1_10号分别是多年生黑麦草和多花黑麦草的种质;
[0027]图4.多花黑麦草中混杂有不同比例多年生黑麦草的PCR鉴定结果。【具体实施方式】
[0028]以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
[0029]实施例1:一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记专用引物,包括有:
[0030]黑麦草专用引物:Lolium-F(5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,
[0031]Lolium-R (5' -3/ ):CTTTGATCCGCATATGTTTGG ;
[0032]实施例2:—种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,包括有:
[0033]第一组:多年生黑麦草PCR检测体系的总体积为20μ 1,其中包括2XPCR Master(20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq 和 2XPCR Buffer)(北京全式金,产品编号:20150320) 10 μ 1,引物 Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTCI μ 1,引物 Lolium-R(5' -3/ ): CTTTGATCCGCATATGTTTGGI μ I,ddH207 μ I ;
[0034]第二组:多花黑麦草PCR检测体系的总体积为20 μ 1,其中包括2XPCRMaster (北京全式金,产品编号:20150320) 10 μ 1,引物 Lolium-F (5 'TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 μ I。
[0035]实施例3:—种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,包括有:
[0036]第一组:多年生黑麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的两倍。
[0037]第二组:多花黑`麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的两倍。
[0038]实施例4:一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,包括有:
[0039]第一组:多年生黑麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的五倍。
[0040]第二组:多花黑麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的五倍。
[0041]实施例5:—种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,包括有:
[0042]第一组:多年生黑麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的十倍。
[0043]第二组:多花黑麦草PCR检测体系与实施例2相同,数量为实施例2的十倍。
[0044]实施例6:—种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记检测方法,包括如下步骤:
[0045]Α.采集种子,采用双层滤纸萌发法,25°C萌发72h,提取萌发种子基因组DNA备用(DNA的提取采用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒,产品目录号:DP305);
[0046]B.利用黑麦草专用引物对多年生黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为 20 μ 1,其中包括 2XPCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq和 2XPCR Buffer) 10μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/y 1,1μ 1,引物 Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 μ I ;扩增条件为:(1)941:预变性31^11;(2)941:变性358 ;(3)54°C 退火 35s ;(4)72°C延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次;(6) 72°C延伸7min ;
[0047]C.利用黑麦草专用引物对多花黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为 20μ 1,其中包括 2XPCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq和 2XPCR Buffer) 10μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/y 1,1μ 1,引物 Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 y I。扩增条件为:1)94°C预变性 3min ;(2)94°C变性 35s ;(3)54°C退火 35s ;(4)72°C延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次;(6) 72°C延伸7min。
[0048]D.PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测;
[0049]E.其电泳扩增条带多年生黑麦草176bp,多花黑麦草156bp。
[0050]其效果为:
[0051]图2显示多年生黑麦草(雅晴)和多花黑麦草(特文)各15个单粒种子基因组DNA为模板的电泳条带清晰明亮,以ddH20为模板的负对照组没有电泳条带。
[0052]表1.15份多年生黑麦草参试材料的信息描述
【权利要求】
1.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记引物,其特征是包括有: 黑麦草专用引物:Lolium-F (5' -3/ ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,
Lolium-R (5' -3/ ):CTTTGATCCGCATATGTTTGG。
2.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒,其特征是包括有:多年生黑麦草 PCR 检测体系,其中包括 2XPCR Master, 20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq和 2XPCR Buffer,引物 Lolium-F (5 ' -3 ' ):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC,引物 Lolium-R(5' -3/ ):CTTTGATCCGCATATGTTTGG,ddH20。
3.一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记方法,其特征是包括如下步骤: A.收集种子,采用双层滤纸萌发法,20°C~30°C萌发72h,提取萌发种子基因组DNA备用; B.利用黑麦草专用引物,对多年生黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测,PCR检测体系总体积为 20 μ 1,其中包括 2XPCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq 和.2 X PCR Buffer) 10 μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/μ 1,I μ 1,引物 Lolium-F (5' -3'):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGGI μ 1,ddH207 μ I ;扩增条件为:(1)94°C 预变性 3min ;(2)94°C 变性 35s ;(3)54°C 退火 35s ;(4).72°C延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次;(6) 72°C延伸7min ; C.利用黑麦草专用引物,对多花黑麦草种子基因组DNA进行PCR检测,PCR检测体系的总体积为 20μ 1,其 中包括 2XPCR Master (20mM MgCl2, 2.5mM dNTP,2.5U/μ I Taq 和.2 X PCR Buffer) 10 μ 1,DNA 模板,浓度为 200ng/μ 1,I μ 1,引物 Lolium-F (5' -3'):TTTCCTCGTTCGAGAGTCTC I μ I,引物 Lolium-R (5 ' -3 ' ): CTTTGATCCGCATATGTTTGG I μ 1,ddH207 μ I ;扩增条件为:(1)941:预变性31^11;(2)941:变性358 ;(3)54°C 退火 35s ;(4).72°C延伸35s ; (5) 2~4步骤循环38次;(6) 72°C延伸7min。 D.PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测; E.其电泳扩增条带多年生黑麦草176bp,多花黑麦草156bp。
【文档编号】C12Q1/68GK103773868SQ201410023022
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】刘志鹏, 刘鹏, 罗栋, 王彦荣, 邰建辉, 王宇 申请人:兰州大学
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