百脉根特异性表达h5n1抗原蛋白的三价ha-2ha1-ltb融合表达载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-LTB融合表达载体。在百脉根植物表达载体的多克隆位点，由2E+35启动子至poly(A)-Nos终止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示的优化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示的优化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ?ID?No.6的优化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ?ID?No.8所示的优化免疫佐剂LTB基因。本发明利用已建立的外源蛋白高水平表达平台进行表达，为广谱H5N1禽流感植物可饲疫苗的研制奠定基础。
【专利说明】百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合表达载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合表达载体。
【背景技术】
[0002]H5N1高致病性禽流感病毒的不断变异和可通过侯鸟迁徙传播等特性，给传统疫苗的研制及免疫途径带来了极大的困难。禽流感病毒具有极高的突变和重组频率，加之其高毒性和潜在感染人的能力，使得禽流感的防控成为一个世界性难题。不断蔓延的疫情给我们再一次敲响了警钟，被动地根据发病病毒亚型进行治疗往往具有滞后性和盲目性，且禽流感病毒具有宿主多样化和随候鸟迁徙等特点，只有建立成熟的疫苗生产平台，研制可广谱免疫中和多种亚型禽流感病毒的植物可饲疫苗，通过在候鸟迁徙地投放，才能从根本上控制甚至消灭禽流感病毒。
[0003]禽流感毒株 A/Hong Kong/156/97 (H5N1)血凝素基因(HA)序列(GenebankN0.AF028709.1)、蛋白序列(AAC40508.1), A/common magpie/Hong Kong/5052/2007 (H5N1)血凝素基因(HA)序列(Genebank N0.CY036173.1)、蛋白序列(ACJ26242.1), A/chicken/Shanxi/2/2006(H5N1)血凝素基因(HA) (Genebank N0.DQ914814.3)、蛋白序列(ABK34764.2)。此3株禽流感血凝素(HA)抗原蛋白包含所有H5HA蛋白的抗原表位，血凝素参与病毒与受体结合、细胞膜融合及进入细胞全过程，是流感病毒表面重要的糖蛋白。大肠杆菌热敏毒素B亚基基因(LT-B)序列(Genebank N0.M17873.1)、蛋白序列(AAA98065.1)均来自 Genbank (http: //www.ncb1.nlm.nih.Rov/Renbank/)大肠木干菌热敏毒素 B 亚基(LTB)能刺激肠道上皮细胞，蹭墙黏膜细胞对抗原通透性，从而增强免疫反应，具有高活性、无毒性的特点。
[0004]利用全价饲料豆科牧草-百脉根(Lotus corniculatus)作为植物生物反应器
生产广谱(可免疫中和所有H5亚型禽流感病毒)禽流感转基因植物可饲用疫苗，是解决这一难题的最有效的途径。通过基因工程技术手段实现抗原蛋白在百脉根中的高水平表达，并在候鸟迁徙地投放转基因植物疫苗，不仅可节省下游纯化的成本，生产低成本的疫苗，更重要的是能够切断禽流感传播途径，实现根本上防控禽流感的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供百脉根特异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合植物表达载体。
[0006]根据本发明的三价HA-2HA1-LTB融合植物表达载体，其特征在于，在百脉根植物表达载体的多克隆位点，由2E+35启动子至Poly(A)-Nos终止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的优化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示的优化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.6的优化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQ IDN0.8所示的优化免疫佐剂LTB基因。
[0007]根据本发明的三价HA - 2HA1 - LTB融合植物表达载体，其中所述百脉根植物表达载体为 pCAMBIA2301。
[0008]本发明分析H5HA蛋白抗原表位多态性，依据主要抗原位点氨基酸差异、宿主、病毒致病性强弱，选取包含所有突变抗原表位的三株H5N1高致病性禽流感毒株即:HK97HA-A/Hong Kong/156/97 (H5N1 )、HK07HAl-A/common magpie/Hong Kong/5052/2007(H5N1)和 SX06HAl-A/chicken/Shanxi/2/2006 (H5N1),以其 HA 为目的抗原蛋白，构建三价HA-2HA1-LTB融合蛋白，并利用多种生物信息学软件对融合蛋白的理化性质、二级结构及三级结构进行预测，结果显示融合蛋白结构稳定、构象合理，具备了通过构建植物融合表达载体，实现在植物中稳定表达的基本条件。
[0009]为进一步提高外源蛋白的表达水平，对目的抗原蛋白基因进行修饰改造。分别对HK97HA.HK07HAUSX06HA1和免疫佐剂LTB基因进行密码子优化，同时对各目的基因起始密码子上游序列进行改造，修饰后基因进行全序列合成。
[0010]根据本发明的技术方案，构建完整融合三株HA抗原蛋白，并添加免疫佐剂LTB的三价HA-2HA1-LTB植物安全高效表达载体。同时根据HA中的HAl是病毒与宿主细胞膜表面受体结合部位，起着诱导机体产生抗体的主要作用，在不降低融合蛋白免疫原性的前提下，为了降低植物表达载体的转化难度，构建完整HK97HA融合HK07HA1和SX06HA1，并添加免疫佐剂LTB的三价HA-2HA1-LTB融合植物表达载体。
[0011 ] 根据本发明的【具体实施方式】，为进一步提高外源蛋白的表达水平，对目的抗原蛋白基因进行修饰改造。分别对HK97HA、HK07HAU SX06H1A和免疫佐剂LTB基因进行密码子优化，同时对各目的基因起始密码子上游序列进行改造，修饰后基因进行全序列合成。在不改变禽流感血凝素抗原蛋白(HA)及免疫佐剂大肠杆菌热敏毒素B亚基(LTB)氨基酸组成的前提下，对抗原蛋白密码子进行优化，以促进提高外源抗原蛋白在受体植物百脉根中的表达水平。包括:
[0012]HK97HA基因的密码子优化
[0013]在不改变HK97HA抗原蛋白氨基酸顺序的前提下，对HK97HA基因进行优化，HK97HA基因全长1707bp，优化后共改变碱基1325bp，即替换了 77.6%的核苷酸。HK97HA基因优化前后的序列分别如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0014]HK97 优化前序列 SEQ ID N0.1
[0015]ATGGAAAGAACAGTGCTTCTTCTTGCAACAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACAGAGCAGGTTGACACAATAATGGAAAAGAATGTTACTGTTACACATGCCCAAGACATACTGGAAAGGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATCTAAATGGAGTGAAGCCTCTCATTTTGAGGGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGGAAACCCTATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAGAAGGCCAGTCCAGCCAATGACCTCTGTTATCCAGGGAATTTCAACGACTATGAAGAACTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCATTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCCAAAAGTTCTTGGTCCAATCATGATGCCTCATCAGGGGTGAGCTCAGCATGTCCATACCTTGGGAGGTCCTCCTTTTTCAGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTGCATACCCAACAATAAAGAGGAGCTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTACTGTGGGGGGTTCACCATCCTAATGATGCGGCAGAGCAGACAAAGCTCTAT CAAAATCCAACCACCTACATTTCCGTTGGAACATCAACACTGAACCAGAGATTGGTTCCAGAAATAGCTACTAGACCCAAAGTAAACGGGCAAAGTGGAAGAATGGAGTTCTTCTGGACAATTTTAAAGCCGAATGATGCC
【权利要求】
1.一种异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA-2HA1-LTB融合表达载体，其特征在于，在百脉根植物表达载体的多克隆位点，由2E+35启动子至poly(A)-Nos终止子方向，正向依次插入核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示的优化HK97HA基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的优化HK07HA1基因、核苷酸序列如SEQ ID N0.6的优化SX06HA1基因和核苷酸序列如SEQID N0.8所示的优化免疫佐剂LTB基因。
2.根据权利要求1所述的异性表达H5N1抗原蛋白的三价HA- 2HA1 - LTB融合表达载体，其特征在于，所述百脉根植物`表达载体为PCAMBIA2301。
【文档编号】C12N15/84GK103865953SQ201410030497
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】吴燕民, 何景成, 张伟伟, 卢运明, 袁蓓, 王维部, 周美亮, 郑平, 唐益雄, 陈肖英 申请人:中国农业科学院生物技术研究所, 深圳市农科集团有限公司