一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法

文档序号:468907
一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法
【专利摘要】一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法,涉及一种基于复合多喷头三维打印技术的仿生复合结构及其制备。该仿生复合结构包括高分子外壳、分支血管支架、功能组织区、血管组织区和高分子隔离层。功能组织区为含组织细胞的水凝胶层;血管组织区为含血管种子细胞的水凝胶层;功能组织区和血管组织区在空间交替排列;高分子隔离层间隔排布在功能组织区和血管组织区内,并将功能组织区和血管组织区分成多个小区域;分支血管支架包括动脉血管和静脉血管两部分。本发明通过复合多喷头3D打印技术制备带分支血管的组织器官仿生结构;水凝胶结构不必交联或聚合;最大限度的模拟了体内血管化组织和血管的状态,为血管化的器官组织提供了借鉴。
【专利说明】一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域,具体到生物或酶、其组合物领域,涉及一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法。
【背景技术】
[0002]近年来,随着学科间的交流联系日益紧密,细胞排列技术应运而生,为组织工程、器官制造和药物筛选奠定了工程基础。其中突出的三维打印技术,也叫快速成形(Rapid Prototyping, RP)技术,利用计算机辅助建模和离散-堆积的原理加工材料[Fedorovich NE, et al.Trends in biotechnology, 2011; 29 (12):601-606] ? 该技术可将生物材料精确定位,在复杂器官的体外组装领域受到高度重视。体外成形的组织或器官用途广泛,可用于研究维持器官正常形态的基理[Griffith LG, et al.Nature ReviewsMolecular Cell Biology, 2006; 7 (3): 211-224]、癌细胞规避化疗等治疗措施[YamadaKM, et al.Cell, 2007; 130(4):601-610]、病变器官的移植[Griffith LG, et al.ScienceSignaling, 2002; 295 (5557): 1009]以及药物筛选。国外许多科研组已完成多种RP技术的改造,以实现基于数控的含细胞三维结构体的组装或打印。国内清华大学机械工程系器官制造中心(Center of Organ Manufacturing)在开发出了一系列快速成型设备,并利用这些设备成功制备出了简单的血管网、肝脏组织和骨修复材料等[Wang XH, etal.Trends in Biotechnology, 2007;25:505; Wang XH, et al.Tissue Engineering PartB, 2010; 16:189; Wang XH.Artificial organs, 2012; 36:591] ? 组装后的细胞 / 基质材料三维结构一般需要交联或聚合天然高分子材料保持三维结构的稳定性。
[0003]从上世纪90年代以来,新药`的开发主要通过基于分子和细胞水平的生物信息检测平台完成,主要利用体外平面二维培养的单种细胞。然而,二维平面培养不能完全模拟人体相应多细胞(至少三种)组织的真实生活三维环境。采用二维培养细胞为靶细胞筛选出来的药物绝大多数在动物体内没有活性[Kang XH, et al.TissueEngineering, 2005; 11:456-458]。近年随着生物研究的微尺度化,生物学家们越来越多的发现细胞生存的各项指标如氧气浓度、生存温度都对细胞的生长状态有着至关重要的影响,这也使得人体组织的体外模拟和培养格外具有挑战性。组合化学、基因组学的发展使得可用于筛选的化合物或药物种类急剧增长,迫使药物筛选的通量需要与时俱进的发展,以往的验证性方法变得不再适用,高通量药物筛选(High throughput Screening, HTS)因此被提出并迅速推广[Rodrigues AD.Pharmaceutical research, 1997;4(11): 1504-1510]。但HTS技术采用单种细胞的二维培养,细胞结构功能不完整,该技术确定的先导化合物并不具后续预期药理活性。采用一种新的更符合人体结构学的成功率高的药物筛选模型——高内涵筛选(High Content Screening, HCS)技术确定先导化合物成为药物研究领域的共识。细胞需要整合来自DNA、RNA、蛋白质、代谢产物和离子等各种物质的提供信息,并表现相应特征;而离子、代谢产物、大分子和细胞器在时间和空间上的相互作用是生物体实现复杂生命功能的基础。因此,要想更加清晰的理解挑选出的靶点在细胞功能中所扮演的角色,就需要一个能够自动提取靶点在细胞中传达出的信息的工具,而这个工具,便是HCS技术[Giuliano KA, et al.Assay and drug development technologies, 2003;I(4):565-577]。相对于HTS技术,HCS技术可实现多靶点选择。HCS使用荧光标记的抗体、DNA探针、生物配体或者生物反应器等手段收集靶点在细胞内的对细胞形态变化、生长、分化、凋亡等各个环节的影响,可在一次试验中获取关于细胞DNA、蛋白质等各个组分的大量信息。相对于以孔板为单位的HCS技术,HTS筛选结果更准确,更具生物学意义。
[0004]专利(申请号200910079726.8)涉及一种基于分区的血管化脂肪组织及其构建方法,将脂肪粒包裹在微囊中,得到具有贯通结构的三维脂肪组织结构体,结构体主要为脂肪区和血管区域。但该方法需要大量的交联剂(如CaCl2),会损害细胞活性;该方法的药物主要通过微囊释放,药效不易作用到整个结构体。专利(申请号200910155794.8)涉及一种糖尿病治疗药物的高内涵筛选方法,通过快速成形技术得到含细胞的三维结构体,并对含胰岛细胞的三维结构进行药物筛选。但该方法并未含血管分支系统,血管内皮细胞仅分布于水凝胶表面。该方法也需要大量的交联剂来稳定成形体。
[0005]现有的组织工程细胞/支架复合结构体能够在体外一定维度上表示出组织或器官的特性,但并不能完全模拟含血管系统的多细胞的真实结构。本发明所使用的水凝胶材料可不必交联,因为高分子隔离层和外壳已经为结构体提供力学支撑;隔离层和外壳在可为宏(微)观多孔结构,保证了营养物质的交换;三维的血管化组织极大程度模拟了体内环境;分支血管结构可与体内外循环系统连接,便于HCS药物筛选。这些因素促使我们利用复合多喷头三维打印技术制备含分支血管的个性化仿生复合结构来模拟体内器官的状态并将其用于药物筛选。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是一种个性化仿生复合结构及其制备和用于药物筛选的方法,使其更好模拟体内的动脉血管和静脉血管状态,结构体不需交联,结构体内的细胞密度能够很高,本发明可作为仿生复合结构来模拟体内血管化组织的状态,进而用于药物筛选。
`[0007]一种个性化仿生复合结构,其特征在于:所述个性化仿生复合结构包括高分子外壳、分支血管支架、功能组织区、血管组织区和高分子隔离层;所述的功能组织区为含组织细胞的水凝胶层;所述的血管组织区为含血管种子细胞的水凝胶层;所述功能组织区和血管组织区在空间交替排列;所述的高分子隔离层间隔排布在功能组织区和血管组织区内,并将功能组织区和血管组织区分成多个小区域;所述分支血管支架包括动脉血管和静脉血管两部分,动脉血管含至少一个入口和若干个分支,静脉血管含至少一个出口和若干个分支;所述的分支血管支架采用合成高分子材料,分支血管支架贯穿于高分子外壳、功能组织区、血管组织区和高分子隔离层之间;所述的高分子外壳采用天然高分子或合成高分子材料。
[0008]上述技术方案中,所述分支血管支架的内径为10 μ m~IOmm,壁厚为100 μ m~2mm ;所述高分子隔离层及高分子外壳的层厚为0.1 μ m~2mm。
[0009]本发明所述功能组织区的含组织细胞的水凝胶层和血管组织区的含血管种子细胞的水凝胶层为天然高分子水凝胶,该天然高分子为明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、胶原、基质胶、卡拉胶、壳聚糖、琼脂、透明质酸、基质胶、弹性蛋白和层粘素中的至少一种;所述天然高分子水凝胶中复合有细胞生长因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黄芪抗癌粉中的至少一种。
[0010]本发明所述天然闻分子水凝胶的质量体积浓度为0.1~40% ;所述血管种子细胞和组织细胞的浓度为IXlO3~IXlO8个/mL;所述功能组织区的组织细胞为成体组织细胞、成体干细胞和癌细胞中的一种;所述血管组织区的血管种子细胞为血管内皮细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
[0011]本发明提供的一种个性化仿生复合结构的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:
[0012]I)设计分支血管支架三维模型,分两组分别模仿动脉血管和静脉血管;
[0013]2)将合成高分子材料、配制好的含组织细胞的水凝胶、配制好的含血管种子细胞的水凝胶和配制好的合成高分子溶液装载到复合多喷头三维打印设备的不同喷头中;
[0014]3)制备分支血管支架:依据步骤I)的三维模型,利用复合多喷头三维打印设备挤出合成高分子溶液,并冻干去除有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,得到分支血管支架;
[0015]4)制备功能组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印配制好的含组织细胞的水凝胶,打印路径沿分支血管支架,间隔打印,得到初步三维结构体;
[0016]5)制备血管组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印,将配制好的含血管种子细胞的水凝胶填充在初步三维结构体的空隙中,得到中间三维结构体;
[0017]6)制备高分子隔离层和高分子外壳:在步骤4)和步骤5)逐层打印过程中,在打印一层或若干层后利用复合多喷头三维打印设备喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子隔离层,得到含细胞的水凝胶层和高分子隔离层的交替结构体;在交替结构体外围喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子外壳,得到个性化仿生复合结构前体;
[0018]7)对上述个性化仿生复合结构前体提供生长因子,实现血管组织区的血管化,使功能组织区形成组织,并使血管组织区和功能组织区的细胞产生联系,最终得到所述的个性化仿生复合结构。
[0019]本发明所述的制备方法中,所述复合多喷头三维打印设备采用熔融挤出成形技术或低温沉积成形技术来制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳;当采用熔融挤出成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖类中的至少一种;当采用低温沉积成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种,所述合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4- 二氧六环。所述合成高分子溶液的质量体积浓度为1%~30% ;所述合成高分子溶液中复合有抗凝血因子,该抗凝血因子为肝素或紫杉醇。
[0020]本发明提供的一种个性化仿生复合结构用于药物筛选的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
[0021]I)若功能组织区的组织细胞采用成体组织细胞或成体干细胞,则对个性化仿生复合结构供给含致病性药物的培养液,使上述个性化仿生复合结构产生病理症状;若功能组织区的组织细胞采用癌细胞,则不做致病性处理;
[0022]2)对个性化仿生复合结构供给含不同种类和不同剂量治疗性药物的培养液,实时或后续搜集培养液;
[0023]3)分析上述已收集培养液,得到治疗性药物的种类、剂量对所述个性化复合结构的作用,通过检测、对比生物学指标,判断药物的作用。
[0024]本发明所述的药物筛选的方法中,所述生物学指标为糖类脂类代谢指标、肝功能指标、肾功能指标、癌细胞指标和血管化指标中的至少一种。所述病理症状为糖尿病、器官炎症、器官衰竭或肿瘤。
[0025]本发明与现有技术相比,有以下优点及突出性的技术效果:①本发明的高分子隔离层将水凝胶层分为若干小区,形成水凝胶层和高分子隔离层交替排布的结构;高分子隔离层为水凝胶结构提供力学支撑和生化保护作用,能够保证低浓度水凝胶的成形;水凝胶不必交联,细胞密度可足够大。②本发明的血管组织区和功能组织区的形成细胞联系,间隔交替排布,模拟了体内血管化组织和血管的状态,为血管化的器官组织提供了借鉴。③本发明的高分子外壳为内部结构提供力学支撑和生化保护作用,有利与所述个性化仿生结构的体内体外培养。④本发明的分支血管支架出口和入口能与体外脉动培养系统或体内血管系统连接。⑤本发明的药物筛选的 方法能及时分析药物对个性化仿生复合结构的作用,利于对代谢疾病、器官疾病或癌症肿瘤的药物筛选工作。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1为个性化仿生复合结构的结构示意图。
[0027]图2为分支血管支架的示意图。
[0028]图3a和图3b分别为打印的功能组织区和血管组织区的示意图。
[0029]图4a和图4b分别为高分子隔离层与功能组织区和血管组织区的交替结构及其爆炸视图。
[0030]图中:101 -动脉血入口 ; 102 -分支血管支架;103 -功能组织区;104 -血管组织区;105 -静脉血出口; 106 -高分子外壳;401 -高分子隔离层。
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0032]图1为个性化仿生复合结构的结构示意图,所述个性化仿生复合结构包括高分子外壳106、分支血管支架102、功能组织区103、血管组织区104和高分子隔离层401 ;所述的功能组织区103为含组织细胞的水凝胶层;所述的血管组织区104为含血管种子细胞的水凝胶层;所述功能组织区103和血管组织区104在空间交替排列;所述的高分子隔离层401间隔排布在功能组织区103和血管组织区104内,并将功能组织区103和血管组织区104分成多个小区域;所述分支血管支架102包括动脉血管和静脉血管两部分,动脉血管含至少一个入口和若干个分支,静脉血管含至少一个出口和若干个分支;所述的分支血管支架102采用合成高分子材料,分支血管支架102贯穿于高分子外壳106、功能组织区103、血管组织区104和高分子隔离层401之间;所述的高分子外壳106采用天然高分子或合成高分子材料。[0033]所述分支血管支架的内径为10 μ m~IOmm,壁厚为100 μ m~2mm ;所述高分子隔离层及高分子外壳的层厚为0.1ym~2mm。图2为分支血管支架示意图,所述功能组织区的含组织细胞的水凝胶层和血管组织区的含血管种子细胞的水凝胶层为天然高分子水凝胶,该天然高分子为明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、胶原、基质胶、卡拉胶、壳聚糖、琼脂、透明质酸、基质胶、弹性蛋白和层粘素中的至少一种;所述天然高分子水凝胶中复合有细胞生长因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黄芪抗癌粉中的至少一种。所述天然高分子水凝胶的质量体积浓度为0.1~40% ;所述血管种子细胞和组织细胞的浓度为I X IO3~I X IO8个/mL ;所述功能组织区的组织细胞为成体组织细胞、成体干细胞和癌细胞中的一种;所述血管组织区的血管种子细胞为血管内皮细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
[0034]本发明提供的一种个性化仿生复合结构的制备方法包括以下步骤:1)设计分支血管支架三维模型,分两组分别模仿动脉血管和静脉血管;2)将合成高分子材料、配制好的含组织细胞的水凝胶、配制好的含血管种子细胞的水凝胶和配制好的合成高分子溶液装载到复合多喷头三维打印设备的不同喷头中;3)制备分支血管支架:依据步骤I)的三维模型,利用复合多喷头三维打印设备挤出合成高分子溶液,并冻干去除有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,得到分支血管支架;4)制备功能组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印配制好的含组织细胞的水凝胶,打印路径沿分支血管支架,如图3a所示,间隔打印,得到初步三维结构体;5)制备血管组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印,如图3b所示,将配制好的含血管种子细胞的水凝胶填充在初步三维结构体的空隙中,得到中间三维结构体;6)制备高分子隔离层和高分子外壳:在步骤4)和步骤5)逐层打印过程中,在打印一层或若干层后利用复合多喷头三维打印设备喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子隔离层,得到含细胞的水凝胶层和高分子隔离层的交替结构体;在交替结构体外围喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子外壳,得到个性化仿生复合结构前体;7)对上述个性化仿生复合结构前体提供生长因子,实现血管组织区的血管化,使功能组织区形成组织,并使血管组织区和功能组织区的细胞产生联系,最终得到所述的个性化仿生复合结构。
[0035]本发所述的制备`方法,所述复合多喷头三维打印设备采用熔融挤出成形技术或低温沉积成形技术来制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳;当采用熔融挤出成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖类中的至少一种;当采用低温沉积成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种,所述合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4- 二氧六环。所述合成高分子溶液的质量体积浓度为1%~30% ;所述合成高分子溶液中复合有抗凝血因子,该抗凝血因子为肝素或紫杉醇。
[0036]本发明提供的一种个性化仿生复合结构用于药物筛选的方法包括如下步骤:1)若功能组织区的组织细胞采用成体组织细胞或成体干细胞,则对个性化仿生复合结构供给含致病性药物的培养液,使上述个性化仿生复合结构产生病理症状;若功能组织区的组织细胞采用癌细胞,则不做致病性处理;2)对个性化仿生复合结构供给含不同种类和不同剂量治疗性药物的培养液,实时或后续搜集培养液;3)分析上述已收集培养液,得到治疗性药物的种类、剂量对所述个性化复合结构的作用,通过检测、对比生物学指标,判断药物的作用。
[0037]本发明所述的药物筛选的方法,所述生物学指标为糖类脂类代谢指标、肝功能指标、肾功能指标、癌细胞指标和血管化指标中的至少一种。所述病理症状为糖尿病、器官炎症、器官衰竭或肿瘤。
[0038]下面举出几个具体的实施例,以进一步理解本发明。
[0039]实施例1:制备一种个性化仿生血管化肝组织并将其应用于肝炎药物筛选
[0040]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和肝细胞(Hep),其中ADSC培养传代后制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与(DMEM,dulbecco's modifiedeagle medium)培养液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,将上述明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比2:2:1混合后得到天然高分子溶液待用;将ADSC和Hep悬浮液离心,分别与天然高分子溶液混合,得到细胞浓度为I X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含H印的天然高分子溶液。
[0041]2)分支血管支架的制备=Solidworks软件设计分支血管三维模型,经分层软件分析后,通过3D打印技术熔融挤压熔融态聚四氟乙烯(TEFLON),得到合成高分子分支血管支架。
[0042]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:同样采用3D打印技术螺杆挤压熔融态TEFLON制备外壳及隔离层;外壳10 μ m厚度,隔离层厚度0.5 μ m。
[0043]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头三维打印技术将含Hep天然高分子沿分支血管支架打印成形,间隔预留50%空间;利用复合多喷头三维打印技术使含ADSC的天然高分子沿上述预留空间成形,成`形体内部可预留孔道;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM,实现肝细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0044]5)肝炎的诱发以及药物筛选:利用脉动系统供给含致病性药物(如双醋酚汀、甲基多巴、呋喃坦啶等)的DMEM诱发药物性肝炎,破坏肝细胞,检测记录生物学指标(如白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酶和酪氨酸氨基转化酶和血管化表达情况);利用脉动系统供给含治疗性药物(如维生素、还原型谷胱甘肽、甘草酸制剂或者新开发的药物)的DMEM进行治疗,记录分析上述生物学指标,得到药物筛选结果。
[0045]实施例2:制备一种个性化仿生血管化肝组织并将其应用于肝炎药物筛选
[0046]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和胚胎干细胞(ESC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为20%的明胶溶液、质量体积浓度为4%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为2%的纤维蛋白原溶液,以上述明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比1:2:1混合后得到天然高分子溶液待用^fADSC和ESC悬浮液分别离心,分别与天然高分子溶液混合,得到细胞浓度为3X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为I X IO5个/mL的含ESC的天然高分子溶液。[0047]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备天然高分子胶原分支血管支架。
[0048]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:实施例1的步骤3)制备天然高分子胶原外壳及隔离层。
[0049]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含ESC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道,将成形体用质量体积浓度为5%的CaCl2溶液和100U/mL的凝血酶溶液交联2min ;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使ESC转化为肝细胞,诱导剂含酸性FGF、HGF、0SM、地塞米松、转铁蛋白等;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分阶段肝细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现肝细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系O
[0050]5)依照实施实例I的步骤4)进行肝炎的诱导发生以及药物筛选。
[0051]实施例3:制备一种个性化仿生血管化肝组织并将其应用于肝炎药物筛选
[0052]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC);将小鼠成纤维细胞内导入转录因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重编程为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液或(phosphate buffered saline)PBS溶液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比2:2:1混合后得到天然高分子待用;最终将ADSC和iPSC悬浮液分别离心,得到细胞浓度为2 X IO5个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0053]2)分支血管支架的制备:实施例1的步骤2)制备合成高分子分支血管支架。
[0054]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:材料为质量体积浓度为5%的PLGA的1,4-二氧六环溶液,利用多喷嘴喷涂喷头组件,将该溶液喷涂至水凝胶层之间,得到水凝胶-PLGA层的交替结构,即为隔离层;最终将该溶液喷涂至结构体外围,得到PLGA外壳。
[0055]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含iPSC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;将成形体浸入PBS溶液,萃取去除1,4-二氧六环有机溶剂;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使iPSC转化为肝细胞,诱导剂含激活素A、bFGF和HGF;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、分阶段肝细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现肝细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0056]5)依照实施实例I的步骤4)进行肝炎的诱导发生以及药物筛选。
[0057]实施例4:制备一种个性化仿生血管化肝癌组织并将其应用于肝癌药物筛选[0058]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC),购买肝癌细胞0fepG2),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为5%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比3:2:1混合后得到天然高分子待用;最终将ADSC和HepG2分别离心,并分别混入天然高分子溶液中,得到细胞浓度为3 X IO5个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含H印G2的天然高分子溶液。
[0059]2)分支血管支架的制备=Solidworks软件设计分支血管三维模型,经分层软件分析后,通过3D打印技术螺杆挤压熔融态ABS,得到分支血管支架。
[0060]3)高分子隔离层和高分子外壳制备:材料为质量体积浓度为5%的PU的四乙二醇溶液,利用多喷嘴喷涂喷头组件,将该溶液喷涂至水凝胶层之间,得到水凝胶-PU层的交替结构,即为保护层;最终将该溶液喷涂至结构体外围,得到PU外壳。
[0061]4)利用复合多喷头3D打印技术将含HepG2的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;将成形体浸入PBS溶液,萃取去除四乙二醇有机溶剂;利用脉动系统供给MEM (minimum essential medium)培养液养液稳定肝癌细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM,实现肝癌细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0062]5)肝癌药物筛选:检测记录成形体的生物学指标(如黄疸水平、白蛋白水平、吲哚氰绿滞留率、葡萄糖-6-磷酸酶和酪氨酸氨基转化酶和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如维生素、化疗性药物、索拉非尼或者新开发的药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。`
[0063]实施例5:制备一种个性化仿生血管化胰腺组织并将其应用于糖尿病的药物筛选
[0064]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和胰岛β细胞(Pan β ),制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液待用;最终将ADSC和Panii悬浮液分别离心,分别混入天然高分子溶液中,得到3 X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及3 X IO6个/mL的含Pan β的天然高分子溶液。
[0065]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子I3U支架。
[0066]3)外壳及隔离层的制备:实施例4的步骤3)制备PU外壳及隔离层。
[0067]4)利用复合多喷头3D打印技术将含Pan β的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统供给培养液稳定胰岛β细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM,实现胰岛β细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系O[0068]5)糖尿病的诱导发生以及药物筛选:利用脉动系统供给链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)直接破坏胰岛β细胞引发2型糖尿病,并检测记录此时生物学指标(如葡萄糖消耗、胰岛素释放、C肽和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如磺脲类、双胍类、格列奈类药物或或者新开发的药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。
[0069]实施例6:制备一种个性化仿生血管化胰腺组织并将其应用于糖尿病的药物筛选
[0070]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和胚胎干细胞(ESC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比2:2:1混合后得到天然高分子待用;最终将ADSC和ESC分别离心,并分别混入天然高分子溶液中,得到细胞浓度为3 X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含ESC的天然高分子溶液。
[0071]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子PEG分支血管支架。
[0072]3)外壳及隔离层的制备:实施例4的步骤3)制备外壳及隔离层。
[0073]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含ESC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使ESC转化为膜岛 β 细胞,诱导剂含Activin A、FGF、CYC、RA、CYC、Extendin_4、IGF和 Nicotinamide等;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分阶段胰岛β细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现胰岛β细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0074]5)依照实施实例5的步骤`4)进行糖尿病的诱导发生以及药物筛选。
[0075]实施例7:制备一种个性化仿生血管化胰腺组织并将其应用于糖尿病的药物筛选
[0076]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC);将小鼠成纤维细胞内导入转录因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重编程为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液,最终将ADSC和iPSC悬浮液分别离心,得到细胞浓度为3 X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0077]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子PCL分支血管支架。
[0078]3)外壳及隔离层的制备:实施例1的步骤3)制备外壳及隔离层。
[0079]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含iPSC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使iPSC转化为膜岛 β 细胞,诱导剂含Activin A、FGF、CYC、RA、CYC、Extendin_4、IGF和 Nicotinamide等;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含分阶段胰岛β细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现胰岛β细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0080]5)依照实施实例5的步骤4)进行糖尿病的诱导发生以及药物筛选。
[0081]实施例8:制备一种个性化仿生血管化胰腺癌组织并将其应用于胰腺癌的药物筛选
[0082]1)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC),购买胰腺癌细胞(PANC-1),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,最终将ADSC和PANC-1分别离心,并分别混入天然高分子溶液中,得到细胞浓度为3X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含PANC-1的天然高分子溶液。
[0083]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子PGA分支血管支架。
[0084]3)外壳及隔离层的制备:实施例4步骤3)制备外壳及隔离层。
[0085]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含PANC-1的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道,利用脉动系统供给MEM培养液稳定胰腺癌细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM,实现胰腺癌细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0086]5)胰腺癌药物筛选:检测记录成形体的生物学指标(如谷丙转氨酶、葡萄糖、CEA、CA 19-9和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如吉西他滨、5-Fu、替吉奥等或者新开发药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。
[0087]实施例9:制备一种个性化仿生血管化肾脏组织并将其应用于肾炎的药物筛选
[0088]1)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和新生鼠肾细胞(NKC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为20%的明胶溶液,将ADSC和NKC悬浮液离心,分别与天然高分子溶液混合,得到细胞浓度为I X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为2 X 107/mL的含NKC的天然高分子溶液。个
[0089]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子PHB分支血管支架。
[0090]3)外壳及隔离层的制备:实施例4步骤3)制备外壳及隔离层。
[0091]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含NKC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统供给培养液稳定肾细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;组合连接合成高分子分支支架,将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM,实现肾细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0092]5)肾炎的诱导发生以及药物筛选:利用脉动系统供给抗生素或非留体类消炎药等破坏NKC,诱发急性间质性肾炎,并检测记录此时生物学指标(如葡萄糖、尿素、尿蛋白肌酐和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如双氢氯噻嗪、呋塞米、激素或者新开发的药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。
[0093]实施例10:制备一种个性化仿生血管化肾脏组织并将其应用于肾炎的药物筛选
[0094]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和胚胎干细胞(ESC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以上述明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比2:2:1混合后得到天然高分子溶液待用;将ADSC和ESC悬浮液离心,分别与天然高分子溶液混合,得到细胞浓度为I X IO5个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为I X IO5个/mL的含ESC的天然高分子溶液。
[0095]2)分支血管支架的制备 :依照实施例1的步骤2)制备合成高分子I3U分支血管支架。
[0096]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:实施例4步骤3)制备外壳及隔离层。
[0097]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含ESC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使ESC转化为肾细胞,诱导剂含FGF-2和LIF等;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含肾细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现肾细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0098]5)依照实施例9的步骤4)进行肾炎的诱导发生以及肾炎药物筛选。
[0099]实施例11:制备一种个性化仿生血管化肾脏组织并将其应用于肾炎的药物筛选
[0100]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC);将小鼠成纤维细胞内导入转录因子(0ct3/4, Sox2, c-Myc和Klf4)重编程为诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cell, iPSC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液、质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以明胶溶液、海藻酸钠溶液和纤维蛋白原溶液体积比1:2:2混合后得到天然高分子待用;最终将ADSC和iPSC悬浮液分别离心,得到细胞浓度为I X IO7个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO7个/mL的含iPSC的天然高分子溶液。
[0101]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子PLGA分支血管支架。[0102]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:实施例1的步骤3)制备外壳及隔离层。
[0103]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含iPSC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统分阶段供给诱导剂使iPSC转化为肾细胞,诱导剂含FGF-2和LIF等;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;组合连接合成高分子分支支架,将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM、含肾细胞诱导剂的DMEM和一般DMEM,实现肾细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0104]5)依照实施例9的步骤4)进行肾炎的诱导发生以及肾炎药物筛选。
[0105]实施例12:制备一种个性化仿生血管化肾癌组织并将其应用于肾癌的药物筛选
[0106]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC),购买肾癌细胞(RCC),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为10%的明胶溶液和质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,以明胶溶液和纤维蛋白原溶液体积比1:1混合后得到天然高分子待用;最终将ADSC和RCC分别离心,并分别混入天然高分子溶液中,得到细胞浓度为3X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为3 X IO6个/mL的含RCC的天然高分子溶液。
[0107]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备天然高分子海藻酸钠分支血管支架,用CaC12 交联。
[0108]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:实施例1的步骤3)制备天然高分子海藻酸钠外壳及隔离层,用CaC12交联。
[0109]4)体外仿生模型的最终确立:利用复合多喷头3D打印技术将含RCC的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统供给MEM培养液稳定肾癌细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的MEM、含HGF的MEM和一般MEM,实现肾癌细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0110]5)肾癌药物筛选:检测记录成形体的生物学指标(如尿素氮、肌酐、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如索拉非尼、贝伐株单抗或者新开发的药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。
[0111]实施例13制备一种个性化仿生血管化淋巴癌组织并将其应用于淋巴癌的药物筛选
[0112]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC),购买淋巴癌细胞(EL4),培养传代后,制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与PBS溶液混合,得到质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液,最终将ADSC和EL4分别离心,并分别混入天然高分子溶液中,得到细胞浓度为2 X IO5个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及细胞浓度为2 X IO5个/mL的含EL4的天然高分子溶液。
[0113]2)分支血管支架的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成天然高分子纤维蛋白原分支血管支架,用100U/mL的凝血酶聚合。
[0114]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:实施例1的步骤3)制备天然高分子纤维蛋白原外壳及隔离层,用100U/mL的凝血酶聚合。
[0115]4)利用复合多喷头3D打印技术将含EL4的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;利用脉动系统供给培MEM养液稳定淋巴癌细胞使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM,实现淋巴癌细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
[0116]5)淋巴癌药物筛选:检测记录成形体的生物学指标(如乳酸盐脱氢酶、碱性磷酸酶、瘤巨细胞和血管化表达情况);利用脉动系统供给治疗性药物如阿霉素、博莱霉素、长春花碱、甲氮咪氨或者新开发的药物,记录并分析生物学指标,进行药物筛选。
[0117]实施例14:制备一种个性化仿生血管化小耳组织
[0118]I)含细胞的水凝胶的制备:提取大鼠脂肪干细胞(ADSC)和软骨细胞(CHO),制备细胞悬浮液;将天然高分子粉末与DMEM培养液混合,得到质量体积浓度为5%的明胶溶液,最终将ADSC和CHO悬浮液分别离心,分别混入天然高分子溶液中,得到3 X IO6个/mL的含ADSC的天然高分子溶液,以及3 X IO6个/mL的含CHO的天然高分子溶液。
[0119]2)分支血管支架`的制备:依照实施例1的步骤2)制备合成高分子ABS分支血管支架。
[0120]3)高分子外壳及高分子隔离层的制备:材料为质量体积浓度为3%的PU的1,4-二氧六环溶液,溶液内混入肝素和瘦素,利用多喷嘴喷涂喷头组件,将该溶液喷涂至水凝胶层之间;利用喷雾喷嘴喷涂PBS溶液,萃取、去除四乙二醇,得到多孔隔离层;得到水凝胶-PU层的交替结构,即为保护层;最终将该溶液喷涂至结构体外围,得到PU外壳。
[0121]4)利用复合多喷头3D打印技术将含CHO的天然高分子沿预先设计的分支血管路径或计算机模型进行三维打印,间隔留出50%的分支血管空间不予细胞组装;之后利用复合多喷头3D打印技术将含ADSC的天然高分子沿上述分支血管内侧预留路径打印,并在打印层内侧预留孔道;将成形体浸入PBS溶液,萃取去除四乙二醇有机溶剂;利用脉动系统供给培养液稳定软骨细胞CHO使其组织化;利用脉动系统供给毛细血管生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF),诱导ADSC分化为毛细血管内皮细胞或平滑肌细胞;将上述结构继续进行脉动体外培养,交替更换含VEGF的DMEM、含HGF的DMEM和一般DMEM,实现CHO细胞的组织化的稳定、血管化的发展以及二者之间的联系。
【权利要求】
1.一种个性化仿生复合结构,其特征在于:所述个性化仿生复合结构包括高分子外壳(106)、分支血管支架(102)、功能组织区(103)、血管组织区(104)和高分子隔离层(401);所述的功能组织区(103)为含组织细胞的水凝胶层;所述的血管组织区(104)为含血管种子细胞的水凝胶层;所述功能组织区(103)和血管组织区(104)在空间交替排列;所述的高分子隔离层(401)间隔排布在功能组织区(103)和血管组织区(104)内,并将功能组织区(103)和血管组织区(104)分成多个小区域;所述分支血管支架(102)包括动脉血管和静脉血管两部分,动脉血管含至少一个入口和若干个分支,静脉血管含至少一个出口和若干个分支;所述的分支血管支架(102)采用合成高分子材料,分支血管支架(102)贯穿于高分子外壳(106)、功能组织区(103)、血管组织区(104)和高分子隔离层(401)之间;所述的高分子外壳(106)采用天然高分子或合成高分子材料。
2.如权利要求1所述的一种个性化仿生复合结构,其特征在于:所述分支血管支架的内径为10 μ m~IOmm,壁厚为100 μ m~2mm ;所述高分子隔离层及高分子外壳的层厚为0.1 μ m ~2mm。
3.如权利要求1或2所述的一种个性化仿生复合结构,其特征在于:所述功能组织区的含组织细胞的水凝胶层和血管组织区的含血管种子细胞的水凝胶层为天然高分子水凝胶,该天然高分子为明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原、胶原、基质胶、卡拉胶、壳聚糖、琼脂、透明质酸、基质胶、弹性蛋白和层粘素中的至少一种;所述天然高分子水凝胶中复合有细胞生长因子、肝素、瘦素、紫杉醇和黄芪抗癌粉中的至少一种。
4.如权利要求3所述的一种个性化仿生复合结构,其特征在于:所述天然高分子水凝胶的质量体积浓度为0.1 ~40% ;所述血管种子细胞和组织细胞的浓度为I X IO3~I X IO8个/mL ;所述功能组织区的组织细胞为成体组织细胞、成体干细胞和癌细胞中的一种;所述血管组织区的血管种子细胞为血管内皮细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、脐血干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
5.—种如权利要求1所述个性化仿生复合结构的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤: 1)设计分支血管支架三维模型,分两组分别模仿动脉血管和静脉血管; 2)将合成高分子材料、配制好的含组织细胞的水凝胶、配制好的含血管种子细胞的水凝胶和配制好的合成高分子溶液装载到复合多喷头三维打印设备的不同喷头中; 3)制备分支血管支架:依据步骤I)的三维模型,利用复合多喷头三维打印设备挤出合成高分子溶液,并冻干去除有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,得到分支血管支架; 4)制备功能组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印配制好的含组织细胞的水凝胶,打印路径沿分支血管支架,间隔打印,得到初步三维结构体; 5)制备血管组织区:利用复合多喷头三维打印设备逐层打印,将配制好的含血管种子细胞的水凝胶填充在初步三维结构体的空隙中,得到中间三维结构体; 6)制备高分子隔离层和高分子外壳:在步骤4)和步骤5)逐层打印过程中,在打印一层或若干层后利用复合多喷头三维打印设备喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子隔离层,得到含细胞的水凝胶层和高分子隔离层的交替结构体;在交替结构体外围喷涂合成高分子溶液并萃取有机溶剂,或熔融挤出合成高分子材料,形成高分子外壳,得到个性化仿生复合结构前体;7)对上述个性化仿生复合结构前体提供生长因子,实现血管组织区的血管化,使功能组织区形成组织,并使血管组织区和功能组织区的细胞产生联系,最终得到所述的个性化仿生复合结构。
6.如权利要求5所述的一种个性化仿生复合结构的制备方法,其特征在于:所述复合多喷头三维打印设备采用熔融挤出成形技术或低温沉积成形技术来制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳;当采用熔融挤出成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子材料为丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、聚氨酯、聚四氟乙烯和糖类中的至少一种;当采用低温沉积成形技术制备分支血管支架、高分子隔离层和高分子外壳时,所述的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚碳酸酯、聚脲酯、聚乙交酯、聚丁二酸酯、聚醚酯、聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种,所述合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4- 二氧六环。
7.如权利要求5所述的一种个性化仿生复合结构的制备方法,其特征在于:所述合成高分子溶液的质量体积浓度为1%~30% ;所述合成高分子溶液中复合有抗凝血因子,该抗凝血因子为肝素或紫杉醇。
8.—种如权利要求1所述个性化仿生复合结构用于药物筛选的方法,其特征在于该方法包括如下步骤: 1)若功能组织区的组织细胞采用成体组织细胞或成体干细胞,则对个性化仿生复合结构供给含致病性药物的培养液,使上述个性化仿生复合结构产生病理症状;若功能组织区的组织细胞采用癌细胞,则不做致病性处理; 2)对个性化仿生复合结构供给含不同种类和不同剂量治疗性药物的培养液,实时或后续搜集培养液; 3)分析上述已收集培养液,得到治疗性药物的种类、剂量对所述个性化复合结构的作用,通过检测、对比生物学指 标,判断药物的作用。
9.如权利要求8所述的一种个性化仿生复合结构用于药物筛选的方法,其特征在于:所述生物学指标为糖类脂类代谢指标、肝功能指标、肾功能指标、癌细胞指标和血管化指标中的至少一种。
10.如权利要求8所述的一种个性化仿生复合结构用于药物筛选的方法,其特征在于:所述病理症状为糖尿病、器官炎症、器官衰竭或肿瘤。
【文档编号】C12Q1/02GK103756955SQ201410030653
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】王小红, 许雨帆 申请人:清华大学
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