四种果树食心虫分子鉴定引物及使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于四种果树食心虫分子鉴定的引物，并公开了分子鉴定引物的序列和分子鉴定引物的使用方法。本发明用于鉴别苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫四种果树食心虫的引物能够扩增四种食心虫的线粒体COI和COII基因，与提供的一种食心虫序列具有99％以上同源性的即为该食心虫，为四种食心虫的鉴别提供简便稳定的分子标记，解决区分和鉴定四种食心虫的难题；从分子水平探索了四种食心虫线粒体COI和COII基因的不同，探索建立四种食心虫的鉴别技术，为今后果树食心虫的生物学、种群动态监测以及综合防治奠定了基础。
【专利说明】四种果树食心虫分子鉴定引物及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种果树病虫鉴别方法，尤其涉及一种四种果树食心虫分子鉴定引物及使用方法。
【背景技术】
[0002]苹果蠹蛾Cydia pomonella属鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae、小卷蛾属Cydia，寄主包括仁果类的苹果、苹果梨、沙果、梨、山楂、海棠，核果类的桃、李、杏、枣、樱桃，浆果类的石榴，胡桃等园艺植物，是重要的世界性果树害虫之一。该虫主要以幼虫蛀果危害并取食种子，有转果为害习性，蛀果率普遍在50%以上，严重时可达100%，常造成大量落果，降低果品的产量和品质。该虫起源于欧洲东南部，之后随着苹果的移植和人为因素扩散到整个欧洲大陆，迄今为止，其已广泛分布于美洲、非洲、澳洲和亚洲除东亚以外的所有苹果产区。苹果蠹蛾是我国重要的入侵害虫，1957年我国首次有文献报道在新疆库尔勒地区苹果蠹蛾的分布，至50年代中后期已遍布新疆全境。20世纪80年代中期该虫进入甘肃省，并持续向东扩张，目前在张掖、酒泉、武威等地严重发生。自2006年以来，该虫在黑龙江省牡丹江市和鸡西市的大部分地区普遍发生，并可能对我国东部苹果优势产区造成威胁。因此，对于苹果蠹蛾的识别和鉴定对于确保我国非疫区果业的建设和出口以及防止苹果蠹蛾在我国的进一步入侵具有重要意义，而苹果蠹蛾的快速鉴定方法是防止其进一步扩展的重要手段。
[0003]梨小食心虫Grapholita molesta Busck属于鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae，简称梨小，义名东方果蛀蛾、桃折心虫，是世界性的主要蛀果害虫之一。梨小食心虫分布于亚洲、欧洲 、北美洲、澳洲，幼虫主要为害梨、杏、桃、李、山楂等的果实和新梢，在不同的寄主植物上为害部位不同，在我国分布很广，从南到北均有发生。为害新梢时，多从新梢顶端的叶柄基部蛀入髓部，由上向下蛀食，蛀孔外有虫粪和树胶，被害嫩梢的叶片逐渐凋萎下垂，最后枯死。果实以梨、桃、杏受害最重。为害梨果时，早期为害的入果孔较大，有虫粪排出，孔口周围变黑腐烂、凹陷，故又称“黑膏药”。后期为害的入果孔很小，孔口周围仍呈绿色，幼虫直向果心蛀食果肉和种子，果面不凹陷变形。梨小食心虫有转移寄主的习性，在桃、梨混栽的果园为害比较严重，为害后不仅影响树冠的扩大和成形，而且严重降低了果质和产量。苹果蠹蛾和梨小食心虫幼虫非常相似，主要靠腹部末端有无臀栉来区分，但是低龄幼虫仍然很难鉴定，即使专业人员也不容易进行准确的鉴定。
[0004]沙果小食心虫Grapholita dimorpha Komai 属鱗翅目 Lepidoptera 卷蛾科Tortricidae，危害沙果、李子和山里红的果实，于1996年在黑龙江报道，为我国新纪录种。成虫将卵产在果实表面，孵化后幼虫钻入果实危害，在果实的蛀孔处有泪珠状果胶流出，幼虫在果实内结茧化蛹，羽化前钻出果实在蛀孔处有蛹壳。沙果小食心虫和梨小食心虫是近缘种，二者在外部形态和生物学特性上非常相似，田间难以正确区分。沙果小食心虫和梨小食心虫这两种害虫主要通过雄性后翅外缘下部凹入的有无、雌性囊突的大小以及果实上蛹壳的有无进行区分，但它们在外部形态及生物学特性上非常相似，极易混淆，对它们的快速准确鉴定十分困难。此外，研究表明梨小食心虫性信息素可以诱到98.8%的梨小食心虫和1.2%的沙果小食心虫，而沙果小食心虫性信息素可以诱到99.7%的沙果小食心虫和
0.3%的梨小食心虫，这更为两种害虫的区分增加了难度。
[0005]李小食心虫Grapholitha funebrana Treitscheke又称李小蠹蛾,隶属于鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae,分布于我国的东北、华北、西北等各地。寄主有李、杏、楼桃、桃、郁李等多种植物，其中以李受害最重。以幼虫驻果危害，蛀果前常在果面上吐丝结网，栖于网下开始啃食果皮蛀入果内，早期入果孔为黑色，数日后即有虫粪排出。豆粒大的果实极易大量脱落，以后被害果在入果孔流出大量水珠状果胶滴。入果后蛀食果仁或纵横串食，并串到果柄附近咬坏输导系统，小果变紫红色，呈“红糖馅”不堪食用。有的果园虫果率竞达80%~90%，造成增产不增收。本种与梨小食心虫很近似，成虫主要区别在于:本种前翅较狭长，前翅颜色淡，为烟灰色；前缘白色钩状纹不明显，有18组，而梨小食心虫则明显，有10组；梨小食心虫前翅中室端部附近有一明显斑点，本种则无。幼虫头部黄褐色。前胸背板浅黄或黄褐色；臀板淡黄褐或玫瑰红色，上有20多个深褐色小斑点；腹足趾钩粗短，为不规则双序，而梨小食心虫细长且为单序，臀栉5~7齿。
[0006]果树食心虫危害严重，蛀果危害时发生隐蔽，尤其是在发生初期很难及时发现，对食心虫发生种类判断不准确，对其发生规律认识不清，经常导致采用错误的防治方法。很多环境友好的防治方法(如昆虫病毒制剂、信息素迷向)都有很强的专一性，这些方法只对某一种害虫有防治效果，因此使用时必须准确地鉴定害虫。苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫这四种食心虫幼虫的外部形态非常相似，而且经常同时在同一果园发生，使传统形态鉴定难度增大，准确性降低。使用信息素诱芯进行种群动态监测时，梨小食心虫的性信息素可以诱集到部分的沙果食心虫和李小食心虫，沙果食心虫的诱芯也可以两集到梨小食心虫和李小食心虫，其成虫也很难区分鉴定，这不仅给预测预报工作带来困难，而且增加了它们有效区分的难度。因此，四种果树食心虫的快速准确鉴定对口岸检疫、预测预报和防治都要重要意义。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中的问题，本发明的目的是提供一种用于苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫四种果树食心虫分子鉴定引物及使用方法。
[0008]为达到上述目的，本发明所采用的技术手段是:用于四种果树食心虫分子鉴定引物，分子鉴定引物的序列为:
[0009]COI 基因上游引物 ClF:5’ -TGGTCACCCAGAAGTTTA-3’
[0010]COI 基因下游引物 CIR:5’ -AAGAGTAACATCAATAGAAG-3’
[0011]COII 基因上游引物 C2F:5’ -ATTGCTTTACCATCTCTTCG-3’
[0012]COII 基因下游引物 C2R:5’ -AAACTATGATTTGCTCCACA-3’。
[0013]上述两对分子鉴定引物的使用方法，包括如下步骤:
[0014]—、提取待鉴定样品的基因组DNA ;
[0015]二、以步骤一所得基因组DNA为模板，利用上述本发明的两对引物对基因组DNA中的线粒体COI和COII基因进行PCR扩增；
[0016]三、取适量步骤二的PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色后，使用1%琼脂糖电泳，于紫外灯下观察，两对引物扩增的片段大小分别为316bp和350bp，将得到的特异性产物测序，利用Om)maS2.4软件读取测序结果，观察峰图并进行校对，通过软件CLUSTALX1.83将所得序列进行多序列同源比对。同一种食心虫中的COI序列相似度为99% -100%，不同食心虫之间COI基因序列相似度是88% -94% ;同一种食心虫中的COII序列相似度为99% -100%，不同食心虫之间COI基因序列相似度是87% -93%。以上即可认为，COI和COII基因相似性都在99%以上的即为同一种食心虫，即通过序列差异来区分四种果树食心虫。
[0017]进一步的，所述步骤二中PCR反应体系和条件为:PCR反应体系为25yL，含2XpCRMaster mixl2.5 μ L，正 / 反向引物各 3 μ L，DNA 模板 2 μ L，含 20 ~50ng DNA, ddH20 补足25 μ L ；PCR反应条件为:94°C下预变性2min ;而后35个循环，每个循环包括94°C变性30s，52°C退火 30s，72。。延伸 30s ;最后 72°C延伸 5min。
[0018]进一步的，所述步骤三中使用1%琼脂糖电泳检测。
[0019]进一步的，所述步骤一中，提取DNA的具体步骤如下:具体步骤如下:将样本置于一无菌的1.5ml离心管中，充分研磨后加入180 μ I常用裂解液(含有IOOmmolpH8.0Tris-HCU25mmol ρΗ8.0EDTA、500mmol NaC1,1% SDS)和 20 μ I 蛋白酶 K，55°C孵育12-15小时至完全裂解；加入20 μ I RNase Α，室温孵育2分钟；12000rpm离心5分钟，转移上清于一无菌离心管中；加入10 μ 110% SDS于裂解液中，立即漩涡5秒；加入700μ I苯酹:氯仿:异戍醇(25:24:1),立即镟润5秒，12000rpm离心10分钟;取上清,加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，12000rpm离心5min ;取上清，加入等体积无水乙醇于裂解物，漩涡混合5秒；将全部的溶液加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃去流出液；吸附柱中加入500 μ 175%乙醇，12000rpm离心30秒,弃去流出液,重复一次；12000rpm离心2分钟,彻底去除残留的乙醇；将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入200μ I预热60°C的TE溶液，室温静置1分钟，12000rpm离心I分钟，洗脱DNA ;重复洗脱DNA得到更多的DNA，洗脱出的DNA于-20°C保存。
[0020]本发明的有益效果在于:与现有技术相比具有:1、结果准确可靠:本发明方法已经对采自小国新疆、甘肃、陕西、河南、河北、山东、山西、湖北、辽宁的食心虫进行鉴定验证，结果的可靠性具有充分的保证；3、操作简便:应用本发明方法，鉴定四种食心虫，一般的普通实验人员即可完成，不需要专业的形态学鉴定知识。2、实用性好:本发明所设计出的引物，可用于四种食心虫幼虫、蛹、成虫的鉴定，只要获得虫体的任何一部分即可鉴定，对样本质量无要求，可以用于田间害虫的准确预测预报，还可以有关检疫口岸对进出口水果的中果树食心虫的检测。鉴别四种食心虫的引物能够扩增四种食心虫的线粒体COI和COII基因，为四种食心虫的鉴别提供简便稳定的分子标记，解决区分四种食心虫的难题；为今后果树食心虫的生物学、种群动态监测以及综合防治奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]下面结合附图和实施例对本发明做进一步的阐述。
[0022]图1为本发明所鉴定的四种果树食心虫的COI和COII基因扩增结果；
[0023]其中，M:DL2000marker ;1、2、9、10 为苹果蠹蛾；3、4、11、12 为梨小食心虫；5、6、13、14为沙果小食心虫；7、8、15、16为李小食心虫；1_8为COI扩增结果，9_16为COII扩增结果。
[0024]图2为本发明苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫COl序列的比对图；
[0025]图3为本发明苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫COII序列的比对图。
[0026]其中，图2和图3中CP代表苹果蠹蛾，GM代表梨小食心虫，GF代表李小食心虫，⑶代表沙果小食心虫。
【具体实施方式】
[0027]实施例1
[0028]1、昆虫样本采集
[0029]2010年和2011年7_9月份于新疆、甘肃、陕西、山东等地采集苹果蠹蛾、梨小食心虫、沙果小食心虫和李小食心虫的幼虫，经专家准确的形态鉴定确认后，置于无水乙醇中-20°C保存。
[0030]表1本发明采集的四种食心虫样本信息
[0031]
【权利要求】
1.四种果树食心虫分子鉴定引物，分子鉴定引物的序列为: COI 基因上游引物 ClF:5’ -TGGTCACCCAGAAGTTTA-3’ COI 基因下游引物 ClR:5’ -AAGAGTAACATCAATAGAAG-3’ COII 基因上游引物 C2F:5’ -ATTGCTTTACCATCTCTTCG-3’ COII 基因下游引物 C2R:5’ -AAACTATGATTTGCTCCACA-3’。
2.根据权利要求1所述的四种果树食心虫分子鉴定引物，其使用方法，特征在于:包括如下步骤: 一、提取待鉴定样品的基因组DNA； 二、以步骤一所得基因组DNA为模板，利用上述两对引物对基因组DNA中的线粒体COI和COII基因进行PCR扩增； 三、取适量步骤二的PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，两对引物扩增的片段大小分别为316bp和350bp，将得到的特异性产物测序，利用Chromas2.4软件读取测序结果，观察峰图并进行校对，通过软件CLUSTALX1.83将所得序列进行多序列同源比对，并利用p-distance计算各食心虫间的遗传距离；结果表明与其中一种食心虫中的序列相似度达到99%以上即可认为是该食心虫，即通过序列差异来区分四种果树食心虫。
3.根据权利要求2所述的四种果树食心虫分子鉴定引物的使用方法，其特征在于:所述步骤二中PCR反应体 系和条件为:PCR反应体系为25μ L，含2XPCR Master mixl2.5μ L,正/反向引物各3 μ L，DNA模板2 μ L，含20~50ng DNA, ddH20补足25 μ L ；PCR反应条件为:94°C下预变性2min ;而后35个循环，每个循环包括94°C变性30s，52°C退火30s，72°C延伸30s ;最后72°C延伸5min。
4.根据权利要求2所述的四种果树食心虫分子鉴定引物的使用方法，其特征在于:所述步骤三中使用1%琼脂糖电泳检测。
5.根据权利要求2所述的四种果树食心虫分子鉴定引物的使用方法，其特征在于:所述步骤一中，提取DNA的具体步骤如下:将样本置于一无菌的1.5ml离心管中，充分研磨后加入 180 μ I 常用裂解液(含有 IOOmmol pH8.0Tris-HCU25mmol pH8.0EDTA,500mmolNaCl,l% SDS)和20 μ I蛋白酶K，55°C孵育12-15小时至完全裂解；加入20 μ I RNaseA,室温孵育2分钟；12000rpm离心5分钟，转移上清于一无菌离心管中；加入10μ 110%SDS于裂解液中，立即漩涡5秒；加入700 μ I苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，立即漩涡5秒，12000rpm离心10分钟；取上清，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，12000rpm离心5min ;取上清，加入等体积无水乙醇于裂解物，漩涡混合5秒；将全部的溶液加入吸附柱中，12000rpm离心30秒,弃去流出液；吸附柱中加入500 μ 175%乙醇,12000rpm离心30秒,弃去流出液，重复一次；12000rpm离心2分钟，彻底去除残留的乙醇；将吸附柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入200 μ I预热60°C的TE溶液，室温静置I分钟，12000rpm离心I分钟，洗脱DNA ;重复洗脱DNA得到更多的DNA，洗脱出的DNA于_20°C保存。
【文档编号】C12N15/11GK103882116SQ201410033127
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】陈茂华, 李玉婷, 郑燕, 王康, 钱路, 吴伟 申请人:西北农林科技大学, 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心, 新源县农业技术推广站