单形拟杆菌l8及在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株新菌株--单形拟杆菌（Bacteroides?uniformis）L8及在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用，该菌株能够将分子量为100～300kDa的琼胶降解为琼胶寡糖并进一步降解为D-半乳糖，或者将分子量0.5～10kDa的琼胶寡糖最终降解为D-半乳糖，同时琼胶寡糖具有特异性促进Bacteroides?uniformis生长的作用，从而达到调节肥胖引起的相关症状的作用。
【专利说明】单形拟杆菌L8及在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种琼胶或琼胶寡糖的降解菌株,特别涉及单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis) L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]琼胶是一种海洋红藻来源的多糖，主要由(I — 3)-13_D-半乳糖(下称G)和(1-4)-3,6-内醚-a-L-半乳糖(下称Α)交替连接而成，琼胶因其特殊的凝胶特性而作为食品添加剂广泛地应用于食品行业。琼胶经过酶降解或是酸降解可以得到分子量相对较低的琼胶寡糖(下称Α0)，近期研究发现琼胶寡糖具有促进肠道中双歧杆菌生长的益生作用。
[0003]健康人的胃肠道内寄居着种类繁多的肠道菌群，大约为IO14左右。肠道菌群与宿主和环境之间始终处于动态平衡状态中，形成一个互相依存，相互制约的系统，因而在机体防御功能正常时其对人体有益无害。正常肠道菌群有着许多重要的生理功能，如对宿主糖尿病、高血压、高血脂的调节作用、免疫作用、排毒作用以及抗肿瘤作用等，但一旦出现肠道菌群失调，势必会扰乱这些正常的生理功能。
[0004]食用益生菌可达到维持胃肠道健康的目的，目前我国批准在食品中使用的益生菌有20余种，主要是乳杆菌和双歧杆菌。研究显示益生菌具有多种生理保健功能，包括对细胞免疫促进作用、处理乳糖不耐症、降低血清胆固醇，调节人体肠道菌群平衡，抗过敏，抑制致癌物质及其他有害微生物。
[0005]益生元是一种膳食补充剂，通过选择性的刺激一种或几种细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响，从而改善寄主健康。成功的益生元应是在通过上消化道时，大部分不被消化而能被肠道菌群所发酵的。最重要的是它只是刺激有益菌群的生长，而不是有潜在致病性或腐败活性的有害细菌。一般认为，益生元给益生菌提供“食物”，能够被肠道内有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖。
[0006]文献(Gauffinet al，PLoS One, 2012, 7(7):e41079)报道，Bacteroidesuniformis CECT7771具有调节肥胖引起的代谢和免疫功能紊乱的作用，具有潜在的益生作用。我们的研究结果发现，琼胶寡糖具有特异性促进Bacteroides uniformis生长的作用。因此，琼胶寡糖与Bacteroides uniformis共同使用时，琼胶寡糖可以通过促进Bacteroides uniformis的增长,从而起到调节肥胖引起的相关症状的作用。
(三)
【发明内容】
[0007]本发明目的 是提供一株新菌株一单形拟杆菌(Bacteroides uniformis) L8及在降解琼胶寡糖(AO)或琼胶(AP)中的应用。
[0008]本发明采用的技术方案是:
[0009]本发明提供一株新菌株一单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)L8,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8711，保藏日期为2014年I月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101。
[0010]本发明还提供所述单形拟杆菌L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用，具体所述的应用方法为:将单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以体积浓度2~10%的接种量接种至琼胶或琼胶寡糖培养基中，25~42°C培养，薄层色谱层析(TLC)跟踪检测至原料聚合度降低至7 (即分子量1098Da)以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解；
[0011]所述琼胶培养基终浓度组成为:琼胶0.5~lg/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘蛋白0.5g/L、3号胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、lml/L 吐温 80、NaC14.5g/L、KC12.5g/L、MgCl2.6Η204.5g/L、CaCl2.6Η200.2g/L、KH2PO40.4g/L、微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.4~6.5 ;所述微量元素终浓度组成为=MgSO4.7Η203.0g/L、CaCl2.2Η200.lg/L、MnCl2.4Η200.32g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CoSO4.7Η200.18g/L、ZnSO4.7Η200.18g/L、CuSO4.5Η200.01g/L、NiCl2.6Η200.092g/L ；
[0012]所述琼胶寡糖培养基终浓度组成为:将琼胶培养基中的琼胶用I~50g/L琼胶寡糖替换，其他组成同琼胶培养基。
[0013]进一步，所述琼胶培养基中琼胶的浓度为0.5~lg/L，所述琼胶的分子量为100~300kDa，优选琼胶培养基中琼胶的浓度为0.8~lg/L，所述琼胶的分子量为100~300kDa。
[0014]进一步，所述琼胶寡糖培养基中琼胶寡糖的浓度为I~50g/L，所述琼胶寡糖的分子量为0.5~IOkDa,优选琼胶寡糖培养基中琼胶寡糖的浓度为10~30g/L，所述琼胶寡糖的分子量为0.5~lOkDa。
[0015]进一步，所述单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以体积比4%~6%的接种量接种。
[0016]更进一步，所述单形拟杆菌L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用为:(I)斜面培养:将单形拟杆菌L8接种至斜面培养基，25~42°C培养2~4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基为在琼胶寡糖培养基中添加质量终浓度1.5%的琼脂粉；
[0017](2)种子培养:从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，25~42°C培养2~4天，获得种子液；所述种子培养基同琼胶寡糖培养基；
[0018](3 )发酵培养:将种子液以体积比4%~6%的接种量接种至琼胶或琼胶寡糖培养基中，25~42°C培养，薄层层析法(TLC)跟踪检测至原料聚合度降低至7 (即分子量1098Da)以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:本发明提供一株新菌株--单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)L8,该菌株能够将分子量为100~300kDa的琼胶降解为D-半乳糖，或者将分子量0.5~IOkDa的琼胶寡糖降解为D-半乳糖，同时琼胶寡糖(分子量为0.5~IOkDa)具有特异性促进Bacteroides uniformis生长的作用，从而达到调节肥胖引起的相关症状的作用。
(四)【专利附图】
【附图说明】[0020]图1为TLC检测B.uniformis L8对AO的降解作用的薄层层析图,Gal:D_半乳糖。
[0021]图2为HPLC检测B.uniformis L8降解AO终产物色谱图，曲线I为单糖标准品HPLC色谱分析图，Man-甘露糖、Rha-鼠李糖、GalA-半乳糖醛酸、Glc-葡萄糖、Gal-D-半乳糖、Xyl-鼠李糖；曲线2为单形拟杆菌L8降解琼胶寡糖192h发酵液HPLC色谱分析图。
[0022]图3为TLC检测B.uniformis L8对AP的降解作用的薄层层析图。
[0023]图4为HPLC检测B.uniformis L8降解AP终产物色谱图，曲线I为单糖标准品HPLC色谱分析图，Man-甘露糖、Rha-鼠李糖、GalA-半乳糖醛酸、Glc-葡萄糖、Gal-半乳糖、Xyl-鼠李糖；曲线2为单形拟杆菌L8降解琼胶192h发酵液HPLC色谱分析图。
(五)【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0025]实施例1菌株L8的分离鉴定
[0026](I)琼胶寡糖的制备与分子量测定
[0027]将IOg琼胶加入IL蒸馏水中(10mg/mL)加热溶解后，加入lmol/LHCl水溶液至HCl终浓度为0.lmOl/L，60°C水浴加热反应lh，反应结束后，向反应液中加入lmol/L NaOH水溶液中和反应液PH值至7，然后采用截留分子量为200~500Da的纳滤膜过滤除盐后，截留液50°C减压浓缩蒸干，获得琼胶寡糖Sg，记为A0。
[0028]取AO 用 0.lmol/L Na2SO4 配制 5mg/ml 溶液，用 TSK-GEL G3000PWXL 凝胶色谱柱(30cmX7.8mm)，采用HP1260型高效液相色谱仪分析测定，流动相为0.lmol/L Na2SO4水溶液，柱温25°C，流速0.5ml/min，采用示差检测器(G1362A，美国安捷伦公司)和多角度激光散射仪(DOWN Heleos II，美国Wyatt公司)检测，经测量AO的分子量为0.5~IOkDa7AO的结构为G-[A-G]n(n为正整数，I≤η≤31，G代表D-半乳糖，A代表3，6-内醚半乳糖)。
[0029](2)培养基的配制
[0030]配制V1-AO液体培养基，具体成分如下:Α0 (分子量0.5~IOkDa) 5g/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘蛋白0.5g/L、3#胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐 0.8g/L、血红素 0.05g/L、吐温 801ml、NaC14.5g/L、KC12.5g/L、MgCl2.6Η204.5g/L、CaCl2.6Η200.2g/L,KH2PO40.4g/L、微量元素 2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH 值为 6.4 ~6.5，灭菌
后置于厌氧工作站。
[0031]微量元素终浓度组成为=MgSO4.7Η203.0g/L、CaCl2.2Η200.lg/L、MnCl2.4Η200.32g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CoSO4.7Η200.18g/L、ZnSO4.7Η200.18g/L、CuSO4.5Η200.01g/L、NiCl2.6Η200.092g/L。
[0032](3)粪便的前处理
[0033]取I名志愿者新鲜粪便，用PBS (pH7.0)配成20% (wt/vol)的悬浮液，充分混匀后用直径为2mm的金属筛过滤，除去大的食物颗粒，得到粪便PBS溶液。
[0034](4)接种培养
[0035]所得粪便PBS溶液接种至V1-AO培养基(接种体积终浓度为2%)，37°C厌氧培养24h进行初步的富集培养。将培养液采用10倍稀释法涂板，平板为V1-AO液体培养基加终浓度2wt%琼脂。平板置于厌氧工作站中37°C培养72h后，于厌氧工作站中挑取单菌落至V1-AO液体培养基中37°C培养144h后取样用于检测降解情况。
[0036](5)薄层色谱层析(TLC)检测降解情况
[0037]所取样品离心后取上清0.2 μ L于硅胶板上点样，以D-半乳糖标准品和反应Oh的样品作为参照，置于甲酸:正丁醇:水(体积比为6:3:1)展开剂中展开后，吹干，在orcinol显色剂(地衣酚-硫酸溶液)中浸润后吹干，120°C加热3min进行显色。根据TLC结果得到可降解AO的阳性克隆，记为菌株L8，图1为TLC检测菌株L8对AO的降解，从图1可以看出培养48h以后琼胶寡糖被降解，培养96h后降解至终产物D-半乳糖。
[0038](6)降解菌的鉴定
[0039]a、菌株L8生理生化特性
[0040]表1菌株L8生化特性(其中-表示阴性，+表示阳性)
[0041]
【权利要求】
1.单形拟杆菌(Bacteroidesuniformis) L8,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8711，保藏日期为2014年I月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
2.—种权利要求1所述单形拟杆菌L8在降解琼胶或琼胶寡糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用方法为:将单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以体积比2~10%的接种量接种至琼胶或琼胶寡糖培养基中，25~42°C培养，薄层层析法跟踪检测至原料聚合度降低至7以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解； 所述琼胶培养基终浓度组成为:琼胶0.5~lg/L、胰蛋白胨3g/L、蛋白胨3g/L、酵母提取物4.5g/L、粘蛋白0.5g/L、3号胆盐0.4g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.8g/L、血红素0.05g/L、lml/L 吐温 80、NaC14.5g/L、KC12.5g/L、MgCl2.6Η204.5g/L、CaCl2.6Η200.2g/L、KH2PO40.4g/L、微量元素2ml/L，溶剂为蒸馏水，pH值为6.4~6.5 ;所述微量元素终浓度组成为=MgSO4.7Η203.0g/L、CaCl2.2Η200.lg/L、MnCl2.4Η200.32g/L、FeSO4.7Η200.lg/L、CoSO4.7Η200.18g/L、ZnSO4.7Η200.18g/L、CuSO4.5Η200.01g/L、NiCl2.6Η200.092g/L ； 所述琼胶寡糖培养基终浓度组成为:将琼胶培养基中的琼胶用I~50g/L琼胶寡糖替换，其他组成同琼胶培养基。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述琼胶分子量为100~300kDa。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述琼胶寡糖分子量为0.5~lOkDa。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述单形拟杆菌L8经种子培养后获得的种子液以体积比4%~6%的接种量接种。
7.如权利要求3所述的`应用，其特征在于所述的应用为: (1)斜面培养:将单形拟杆菌L8接种至斜面培养基，25~42°C培养2~4天，获得斜面菌体；所述斜面培养基为:在琼胶寡糖培养基中添加质量终浓度1.5%琼脂粉； (2)种子培养:从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，25~42°C培养2~4天，获得种子液；所述种子培养基同琼胶寡糖培养基； (3)发酵培养:将种子液以体积比4%~6%的接种量接种至琼胶或琼胶寡糖培养基中，25~42°C培养，薄层层析法跟踪检测至原料聚合度降低至7以下，实现琼胶或琼胶寡糖的降解。
【文档编号】C12R1/01GK103865844SQ201410054976
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】王欣, 于广利, 李苗苗, 尹业师 申请人:浙江省农业科学院, 中国海洋大学